發(fā)布時間：2017-06-24 15:09

  本文關鍵詞：雷公藤紅素與漢黃芩素聯(lián)合應用對腫瘤細胞能量代謝的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著科技的不斷進步,人類的生存環(huán)境污染日益加劇,癌癥己成為威脅人類生存的首要因素。癌癥治療的主要手段有放、化療及手術切除,這些治療方法對于人體正常細胞均有一定程度的影響。近年來傳統(tǒng)中藥對于腫瘤防治作用得到了研究者的廣泛關注。雷公藤紅素與漢黃芩素為中藥有效活性成分,兩者均有抗癌、抗炎、抗病毒和抑菌等作用。但由于雷公藤紅素的細胞毒作用較強,漢黃芩素給藥劑量較高,影響了兩種藥物在臨床上的應用。本課題采取雷公藤紅素和漢黃芩素聯(lián)合給藥的方法來降低細胞毒作用,減少給藥劑量,提高抗腫瘤活性。目的：通過研究雷公藤紅素(Celastrol)和漢黃芩素(Wogonin)單獨用藥和聯(lián)合應用對三種細胞—人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV304)、人胃癌細胞(SGC-7901)和人肺癌細胞(A549)增殖活性及能量代謝的影響,表明聯(lián)合用藥較單獨用藥能更好地降低細胞毒作用,減少給藥劑量,提高抗腫瘤活性。方法：1.采用MTT法測定對腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞的抑制率；2.細胞計數(shù)法繪制生長曲線判定對腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞的生長趨勢的影響；3.采用HE染色法觀察對腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞的形態(tài)變化；4.采用分光光度法測定腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞內(nèi)糖酵解途徑中的限速酶類己糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶,三羧酸循環(huán)中的標志酶琥珀酸脫氫酶及能量代謝終產(chǎn)物ATP含量水平；5.采用Western blot法分析細胞內(nèi)低氧誘導因子(HIF-1α)和單羧基轉(zhuǎn)運體(MCF-4)表達水平。結果：1.通過MTT結果確定最佳聯(lián)合給藥濃度,分別為漢黃芩素15gg·mL-1,雷公藤紅素3μg.mL-1；2.HE染色和生長曲線結果表明聯(lián)合給藥組較單獨用藥組對SGC-7901、ECV304增殖抑制顯著、形態(tài)變化明顯,尤以SGC-7901作用最強,表現(xiàn)為細胞變圓,體積縮小,核深染,胞質(zhì)凝集和顏色變深,細胞濃度顯著降低。對A549的增殖抑制作用較弱。3.細胞的生長與增殖離不開能量的供給,腫瘤細胞由于低氧微環(huán)境的誘導作用,糖酵解供能途徑起主導作用,實驗中檢測了糖酵解途徑中的酶類包括己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶的含量變化。結果顯示聯(lián)合用藥對三種不同細胞的酶活性抑制強度不同,對己糖激酶活力抑制率在人臍靜脈上皮細胞(ECV304)和人胃癌細胞(SGC-7901)較高,在人肺癌細胞(A549)無明顯變化,聯(lián)合用藥對三種細胞的丙酮酸激酶活力均無影響。乳酸脫氫酶活力測定結果顯示聯(lián)合用藥明顯降低了三種細胞乳酸脫氫酶的活力,提示腫瘤細胞的酸性微環(huán)境被改變其增殖將被抑制。琥珀酸脫氫酶是線粒體的標志性酶,檢測結果表明聯(lián)合用藥對SGC-7901內(nèi)琥珀酸脫氫酶抑制作用顯著,對ECV304次之,對A549不明顯。ATP是細胞能量的主要供給者,聯(lián)合用藥能夠顯著降低ECV304和SGC-7901中ATP含量。4.低氧誘導因子1α (HIF-1α)是細胞增殖和糖酵解途徑調(diào)節(jié)的重要蛋白,單羧基轉(zhuǎn)運體(MCT-4)是將乳酸分泌到細胞外,維持細胞酸性微環(huán)境的主要蛋白,聯(lián)合給藥能顯著降低SGC-7901和ECV304細胞內(nèi)HIF-1α和MCT-4表達水平,而對A549細胞中兩種蛋白的表達影響較小。結論：雷公藤紅素與漢黃芩素聯(lián)合用藥較單獨用藥能明顯降低人胃癌細胞SGC-7901和人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304中HIF-1α和MCT-4表達水平,干擾能量代謝,抑制糖酵解途徑中己糖激酶和乳酸脫氫酶和氧化磷酸化中的琥珀酸脫氫酶的活性,降低ATP的含量,達到抑制人胃癌細胞SGC-7901和人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304增殖的作用,而對A549的作用不顯著。說明聯(lián)合用藥對人胃癌細胞SGC-7901作用較強,對人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304有一定的影響,可抑制胃癌細胞增殖和腫瘤血管生成。
【關鍵詞】：雷公藤紅素 漢黃芩素 癌細胞 酶 能量代謝 ATP
【學位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 緒論12-18
• 1.1 雷公藤紅素的研究進展12-15
• 1.1.1 雷公藤紅素誘導腫瘤細胞凋亡12-13
• 1.1.2 雷公藤紅素影響腫瘤細胞周期13-14
• 1.1.3 雷公藤紅素抑制血管生成14
• 1.1.4 雷公藤紅素抑制腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移14-15
• 1.1.5 其他15
• 1.2 漢黃芩素的研究進展15-16
• 1.2.1 漢黃芩素促進腫瘤細胞的凋亡15
• 1.2.2 漢黃芩素抑制腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移15-16
• 1.2.3 漢黃芩素逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性及促癌細胞分化16
• 1.2.4 其他16
• 1.3 腫瘤的能量代謝16-18
• 2 雷公藤紅素與漢黃芩素體外聯(lián)合抗腫瘤活性研究18-29
• 2.1 引言18
• 2.2 材料與儀器18-20
• 2.2.1 細胞株18
• 2.2.2 試劑18-19
• 2.2.3 儀器19
• 2.2.4 試劑配制19
• 2.2.5 細胞培養(yǎng)19-20
• 2.3 MTT法選擇聯(lián)合用藥中雷公藤紅素和漢黃芩素劑量20
• 2.4 MTT法測定細胞存活率20
• 2.5 生長曲線法繪制細胞增殖曲線20-21
• 2.6 HE染色觀察細胞形態(tài)變化21
• 2.7 統(tǒng)計與分析21
• 2.8 結果與分析21-28
• 2.8.1 聯(lián)合用藥中漢黃芩素、雷公藤紅素劑量選擇21-23
• 2.8.2 MTT法測定聯(lián)合用藥對細胞增殖活性的影響23-24
• 2.8.3 生長曲線法繪制增殖曲線24-25
• 2.8.4 HE染色法觀察細胞形態(tài)學變化25-28
• 2.9 小結28-29
• 3 雷公藤紅素與漢黃芩素聯(lián)合對腫瘤細胞能量代謝的影響29-43
• 3.1 引言29
• 3.2 材料與儀器29-30
• 3.2.1 細胞株29
• 3.2.2 試劑29
• 3.2.3 儀器29-30
• 3.3 樣品干預與處理30
• 3.3.1 細胞干預與收集30
• 3.3.2 樣品的處理30
• 3.4 細胞蛋白濃度測定30-31
• 3.5 糖酵解途徑酶活力測定31-32
• 3.5.1 糖激酶(HK)活力測定31
• 3.5.2 丙酮酸激酶(PK)活力測定31-32
• 3.5.3 乳酸酸脫氫酶(LDH)活力測定32
• 3.6 氧化磷酸化酶-琥珀酸脫氫酶(SDH)活力測定32-33
• 3.7 糖代謝產(chǎn)物-三磷酸腺昔(ATP)含量測定33-34
• 3.8 結果與分析34-41
• 3.8.1 蛋白濃度測定34
• 3.8.2 糖激酶活力34-35
• 3.8.3 丙酮酸激酶活力35-37
• 3.8.4 乳酸脫氫酶活力37-38
• 3.8.5 琥珀酸脫氫酶活力38-39
• 3.8.6 細胞內(nèi)ATP含量39-41
• 3.9 小結41-43
• 4 聯(lián)合用藥對腫瘤細胞能量代謝影響的機制研究43-50
• 4.1 引言43
• 4.2 儀器與材料43-45
• 4.2.1 細胞株43
• 4.2.2 試劑43-44
• 4.2.3 儀器44
• 4.2.4 試劑配制44-45
• 4.3 蛋白收集與定量45
• 4.3.1 蛋白的收集45
• 4.3.2 蛋白定量45
• 4.4 Western-Blot檢測細胞中低氧誘導因子-1α(HIF-1α)和單羧基轉(zhuǎn)運體(MCT-4)45-46
• 4.4.1 蛋白電泳45-46
• 4.4.2 轉(zhuǎn)膜46
• 4.4.3 抗體孵育46
• 4.4.4 影與掃描46
• 4.5 結果與分析46-49
• 4.5.1 蛋白定量46
• 4.5.2 低氧誘導因子和單羧基轉(zhuǎn)運體的表達變化46-49
• 4.6 小結49-50
• 討論50-54
• 結論54-55
• 參考文獻55-61
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文61-62
• 致謝62

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