本文關(guān)鍵詞：新型去乙�；敢种苿┖駱惴蛹せ頣RAIL通路誘導(dǎo)NSCLC凋亡的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率為每年150萬(wàn)人,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌分型的大約85%。最近的研究顯示,腫瘤組織中抑癌基因常會(huì)發(fā)生表觀遺傳改變,隨之而來(lái)的細(xì)胞形態(tài)的改變與肺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)�；诒碛^遺傳變化的動(dòng)態(tài)和可逆的特點(diǎn),表觀遺傳變化是肺癌化學(xué)預(yù)防和治療的潛在目標(biāo)。組蛋白乙�；图谆欠伟┲醒芯糠浅V泛的表觀遺傳機(jī)制。組蛋白乙�；怯扇ヒ阴；�(HDAC)和乙�；�(HAT)共同調(diào)節(jié),在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色。去乙�；冈谌梭w中可以分為四類：I型是HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8, Ⅱ型是HDAC4-HDAC7、HDAC9、HDAC 10,Ⅲ型是Sirtl-Sirt7,Ⅳ型是HDAC11。Ⅰ型HDACs在各種腫瘤組織都是高表達(dá)的,主要是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移,最終導(dǎo)致預(yù)后差和耐藥性。因此,大量的研究表明有針對(duì)肺癌的去乙�；傅囊种苿�(HDACi),特別是針對(duì)I型HDACs.這些HDACi作為有效的治療肺癌的抗腫瘤制劑,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展,血管生成、轉(zhuǎn)移和遷移達(dá)到治療目的。HDACi可以通過(guò)TRAIL信號(hào)通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性,其抑制劑可以誘導(dǎo)增加膜表面的TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)的表達(dá),并啟動(dòng)半胱天冬酶(Caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)凋亡。迄今為止,美國(guó)食品藥物監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)了一些合成的HDACi,包括丙戊酸、曲古抑菌素(TSA)、異羥肟酸和MS-275作為癌癥治療藥物。但是,這些抑制劑的副作用和慢性毒性限制其廣泛的應(yīng)用,越來(lái)越多的證據(jù)證明日常膳食和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中的化合物具有低毒性和強(qiáng)大的生物活性可以通過(guò)表觀遺傳學(xué)的作用機(jī)理抑制肺癌。因此,來(lái)源于天然植物或食物探索新型抗癌藥物,可以調(diào)節(jié)表觀遺傳學(xué)的變化達(dá)到治療和預(yù)防非小細(xì)胞肺癌的目的是非常必要的。厚樸酚是從厚樸提取的一種生物活性的化合物,具有很多藥理活性,例如抗腫瘤、抗抑郁、抗氧化和抗炎的作用。很多證據(jù)表明厚樸酚可以作為抗腫瘤制劑治療多種類型的腫瘤,其包括肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌。厚樸酚作為抗腫瘤制劑可以通過(guò)很多分子機(jī)制包括非依賴性Caspase誘導(dǎo)凋亡通路和HIF-1α/VEGF信號(hào)通路達(dá)到抗腫瘤作用。厚樸總酚(PM)也是從厚樸提取的總酚類物質(zhì),其包含很多有效成分如厚樸酚、和厚樸酚及厚樸新酚等。有文獻(xiàn)報(bào)道厚樸總酚可以抑制移植瘤腫瘤的生長(zhǎng)。但是,厚樸總酚中還不明確哪些成分起到抗腫瘤作用,也不未闡明總酚類物質(zhì)是否比單體效果更好。據(jù)研究報(bào)道,和厚樸酚是厚樸酚的同分異構(gòu)體,可以抑制表觀遺傳學(xué)中Ⅰ型HDACs的活性。盡管闡明了和厚樸酚抗腫瘤的機(jī)制,但是厚樸酚和厚樸總酚的抗腫瘤機(jī)制還不夠明確,特別是表觀遺傳修飾機(jī)制需進(jìn)一步闡明。研究目的本文研究目的在于考察厚樸酚和厚樸總酚對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549和H1299細(xì)胞中Ⅰ型HDACs的影響,并探索厚樸酚及厚樸總酚在體內(nèi)外是否能作為HDACi誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。探索和發(fā)展新穎有效無(wú)毒并能調(diào)節(jié)表觀遺傳學(xué)的天然化合物對(duì)于治療和預(yù)防肺癌是非常有必要的。研究方法本研究采用MTT法、Real-time PCR,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡、Western blot、ChIP、裸鼠移植瘤模型、化學(xué)誘導(dǎo)肺癌模型和免疫熒光等技術(shù),深入考察厚樸酚和厚樸總酚在體內(nèi)外的抗肺癌作用及其機(jī)制。1.MTT法細(xì)胞活力測(cè)試取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、H1299和H226細(xì)胞,4000/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后,棄去原來(lái)培養(yǎng)基,按設(shè)計(jì)的藥物濃度厚樸酚(0,10,20,40,60,80,100,120,150 μM)和厚樸總酚(0,4,8,16,21,26,32,40 μg/mL)分別作用于48 h后停止培養(yǎng),然后加入0.5 mg/mL的MTT溶液,處理4 h后,棄上清,最后加入150μL DMSO振蕩混勻,置于酶標(biāo)儀中測(cè)定其吸光度值,測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。細(xì)胞的活力相對(duì)于空白組的生存率為100%計(jì)算。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期A549、H1299、H226細(xì)胞經(jīng)厚樸酚(0,15,30,60 μM)和厚樸總酚(0,4,8,16 μg/mL)處理48 h后,胰酶消化細(xì)胞,用PBS清洗后用預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞,密封保存于4。C冰箱過(guò)夜。次日,離心,用PBS洗一次,接著加入1 mL PBS,混勻后過(guò)篩,再加入500μL PI,渦旋混勻,然后將細(xì)胞置于37。C避光孵育30 mmin,充分混勻后,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,用F1owJo v7.6軟件處理數(shù)據(jù)。3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡A549和H1299細(xì)胞經(jīng)厚樸酚(0,15,30,60μM)和厚樸總酚(0,4,8,16-g/mL)處理48 h后,用胰酶消化細(xì)胞,用PBS清洗。然后用100μL 1xBinding buffer重懸細(xì)胞,再加入Annexin-V和PI各5 μL,在37。C避光孵育15 min。孵育完后,再加入400 μL lx Binding buffer重懸細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,用FlowJo v7.6軟件處理數(shù)據(jù)。4. Real-time PCR檢測(cè)I型HDACs和TRAL,及其受體基因表達(dá)水平A549和H1299細(xì)胞經(jīng)厚樸酚(0,15,30,60μM )和厚樸總酚(0,4,8,16 lag/mL)處理48h后,用TRIzol提取試劑提取細(xì)胞的mRNA,然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將lnRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后用SYBR Green real-time PCR試劑盒擴(kuò)增cDNA,并用ABI 7500 system定量。5. Western blot方法分析各蛋白的表達(dá)水平A549和H1299細(xì)胞經(jīng)厚樸酚(0,1 5,30,60 μM)和厚樸總酚(0,4,8,16 gg/mL)處理48 h后,或者用TSA(500 nM)預(yù)處理24 h,用胰酶消化收集細(xì)胞,提取總蛋白或核蛋白。蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳(壓縮膠為5%,分離膠為12%)分離,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。采用Western blot檢測(cè)關(guān)鍵蛋白(I型HDACs、Ac-H3、Ac-H4,AC p53, AC p65和凋亡關(guān)鍵蛋白)。利用β-actin和Histone H3作為內(nèi)參,用ECL化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)化信號(hào),蛋白的相對(duì)含量采用QuantityOne軟件進(jìn)行分析。6. ChIP方法考察DR5基因的乙�；稽c(diǎn)A549和H1299細(xì)胞經(jīng)厚樸酚(60 μM)和厚樸總酚(16 μg/mL)處理后,用1%甲醛固定,用PierceTM Agarose ChIP Kit提取試劑盒提取DNA。DNA采用H3K27ac (4pg)孵育過(guò)夜。純化的DNA (-1bp～-2500bp,2.5kb)用DR5特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列為正引物：5'-GGCGGCAGAGAAGACTTAAT-3';反引物：5'-CCTGAGGATGGAGACCTTATTTC-3'。采用10%input作為對(duì)照。7.建立A549異移植瘤模型考察厚樸酚及厚樸總酚的抗腫瘤作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2 x106A549細(xì)胞混懸于PBS接種于裸鼠右側(cè)腋下。當(dāng)平均腫瘤體積達(dá)到50-100 mm3時(shí),分為4個(gè)組,每組7只。實(shí)驗(yàn)小鼠采用灌胃給藥,具體給藥劑量和方法如下：厚樸酚及厚樸總酚(20 mg/kg)溶解于200 μL玉米油中,最終濃度為2 mg/mL,每周給五次；阿法替尼(5 mg/kg)混懸于含有0.5%甲基纖維素和0.4%吐溫-80的生理鹽水中,最終濃度為0.5 mg/mL灌胃給藥每周五次；對(duì)照組給予0.1 mL/10g的玉米油,灌胃給藥,每周五次。實(shí)驗(yàn)小鼠給藥時(shí)長(zhǎng)為4周,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),處死全部小鼠,剝?nèi)∧[瘤,記錄腫瘤的濕重。腫瘤體積利用游標(biāo)卡尺每3天測(cè)量1次,計(jì)算公式為TV(mm3)=1/2×(L×W2),公式中L為腫瘤的縱向長(zhǎng)度,W為腫瘤橫向長(zhǎng)度。8. TUNEL方法檢測(cè)免疫組化的凋亡細(xì)胞選用In Situ Cell Death Detection Kit,POD試劑盒,根據(jù)其使用方法,利用TUNEL方法檢測(cè)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡情況,TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞利用熒光顯微鏡采集數(shù)據(jù)。9.化學(xué)誘導(dǎo)肺癌模型考察厚樸酚及厚樸總酚的預(yù)防作用C57/B6小鼠適應(yīng)一周后,用600 mg/kg烏拉坦進(jìn)行造模,每周造模一次,共15周。第一次造模后根據(jù)體重進(jìn)行分組給藥,組別為空白模型組、厚樸酚(10mg/kg)、厚樸總酚組(10 mg/kg)。每組為20只,每周給藥五次,每周測(cè)量體重；給藥至30周。30周后進(jìn)行解剖,取材,并且觀察肺部結(jié)節(jié)及大小。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS軟件利用單因素方差分析方法(one-way ANO VA)進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析,所有數(shù)據(jù)結(jié)果以mean±SD表示,p0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.厚樸酚及厚樸總酚抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的活力采用MTT和流式細(xì)胞儀方法考察對(duì)A549、H1299和H226細(xì)胞的影響。A549和H1299作用于厚樸酚及厚樸總酚48 h后,細(xì)胞活力隨著濃度增加而減弱,且具有濃度依賴性。2.厚樸酚及厚樸阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。接著我們考察厚樸酚及厚樸總酚對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。厚樸酚及厚樸總酚使A549和H1299阻滯在G0/G1期,使H226細(xì)胞阻滯在S期。此外,隨著厚樸酚及厚樸總酚濃度的增加,能顯著誘導(dǎo)A549和H1299細(xì)胞的凋亡。3.厚樸酚及厚樸總酚抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞I型HDACs的蛋白表達(dá)和功能厚樸酚及厚樸總酚能顯著抑制細(xì)胞活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為了進(jìn)一步探索其機(jī)制,檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞核內(nèi)I型HDACs的影響。與對(duì)照組相比,厚樸酚及厚樸總酚能顯著下調(diào)HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8的蛋白水平,且具有濃度依賴性。但厚樸酚及厚樸總酚不能影響I型HDACs基因水平。由于I型HDACs能影響基因中的組蛋白和非組蛋白去乙�；�,因此考察厚樸酚及厚樸總酚對(duì)組蛋白Histone H3(H4)和非組蛋白p53、p65的乙�；饔�。厚樸酚及厚樸總酚能顯著的增加Histone H3 (H4)的乙�；�(Acetylation, AC)蛋白水平,有趣的是,厚樸酚增加AC Histone H3的蛋白水平較AC Histone H4強(qiáng)。厚樸酚及厚樸總酚也能顯著增加非組蛋白p53和p65在A549細(xì)胞中的乙�；�。在p53缺失型的H1299細(xì)胞中,厚樸酚及厚樸總酚能顯著增加AC p65的蛋白水平。4.厚樸酚及厚樸總酚激活TRAIL通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡厚樸酚及厚樸總酚抑制I型HDACs,考察其是否可以激活TRAIL通路,影響下游關(guān)鍵蛋白。厚樸酚及厚樸總酚使DR5的基因水平上調(diào)。相對(duì)于對(duì)照組,厚樸酚及其厚樸總酚能顯著增加凋亡蛋白Bax的水平,同時(shí),降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。此外,厚樸酚及厚樸總酚誘導(dǎo)DR5、caspase 3、cleaved caspase 3和cleaved PARP蛋白的高表達(dá)。然而,厚樸酚及厚樸總酚對(duì)caspase 8無(wú)明顯的影響。5.厚樸酚及厚樸總酚部分依賴抑制I型HDACs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡采用Western blot和流式細(xì)胞儀考察厚樸酚及厚樸總酚誘導(dǎo)的凋亡是否依賴于I型去乙�；�。60μM厚樸酚在A549和H1299細(xì)胞可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,凋亡分別為64.40±0.73%和13.67±0.62%。當(dāng)用HDACi (TSA)預(yù)處理24 h后,I型HDACs蛋白表達(dá)下降,但在H1299細(xì)胞中未顯著誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。結(jié)果顯示用500 nM TSA預(yù)處理24 h可以抑制I型HDACs的活性。TSA預(yù)處理24h后,繼續(xù)用60μM厚樸酚處理48 h后,A549和H1299細(xì)胞凋亡率下降至39.05±1.48%和42.50±0.71%。相似地,16 gg/mL厚樸總酚用TSA預(yù)處理后,細(xì)胞A549和H1299細(xì)胞凋亡率下降至7.61±0.86%和8.79±0.95%。這些結(jié)果顯示,厚樸酚及厚樸總酚通過(guò)I型HDACs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但不是唯一機(jī)制。同時(shí),厚樸酚及厚樸總酚通過(guò)抑制I型HDACs可使DR5基因的啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27位點(diǎn)高度乙�；�。6.厚樸酚及厚樸總酚抑制I型HDACs而發(fā)揮抗腫瘤活性厚樸酚及厚樸總酚通過(guò)A549異移植瘤模型考察其體內(nèi)抗腫瘤作用。相對(duì)于對(duì)照組,給藥組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,同時(shí),阿法替尼、厚樸酚及厚樸總酚能顯著的抑制腫瘤體積。厚樸酚及厚樸總酚對(duì)腫瘤的抑制率分別為44.40%和35.45%。利用Western blot方法檢測(cè)各關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示厚樸酚及厚樸總酚抑制1型HDACs (HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8)的蛋白水平。此外,厚樸酚及厚樸總酚上調(diào)AC histone H3、AC histoneH4、AC p53和AC p65的蛋白水平。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果顯示,厚樸酚及厚樸總酚誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞明顯較對(duì)照組多。同時(shí),厚樸酚及厚樸總酚增加DR5、Bax、caspase 3、cleaved caspase 3、cleaved PARP和caspase 8的蛋白水平,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)。7.厚樸酚及厚樸總酚預(yù)防肺癌的發(fā)生和發(fā)展與空白對(duì)照組相比,厚樸酚及厚樸總酚能有效的減少肺部結(jié)節(jié),且無(wú)明顯毒性,可以作為預(yù)防藥物長(zhǎng)期給藥。主要結(jié)論綜上所述,本研究證實(shí)厚樸酚及厚樸總酚作為1型HDACi,阻滯細(xì)胞周期和激活TRAIL通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗肺癌作用。1.厚樸酚和厚樸總酚對(duì)A549、H1299、H226細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用,其中,對(duì)A549和H1299細(xì)胞的抑制最強(qiáng),且可以誘導(dǎo)A549和H1299細(xì)胞的凋亡。2.厚樸酚及厚樸總酚抑制I型HDACs(HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8的蛋白水平。同時(shí),通過(guò)是組蛋白和非組蛋白乙�；�,增加AC Histone H3、AC HistoneH4、AC p53和AC p65的蛋白水平。3.厚樸酚和厚樸總酚通過(guò)下調(diào)G0/G1期關(guān)鍵蛋白cyclin D1使A549和H1299阻滯在G0/G1期。4.厚樸酚及厚樸總酚能作為I型HDACi激活TRAIL通路誘導(dǎo)A549和H1299的細(xì)胞凋亡,但不是其誘導(dǎo)凋亡的唯一機(jī)制。5.厚樸酚和厚樸總酚通過(guò)抑制I型HDACs抑制A549異移植瘤的生長(zhǎng)而發(fā)揮抗腫瘤作用。在體內(nèi),厚樸酚和厚樸總酚可以通過(guò)TRAIL通路誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在化學(xué)誘導(dǎo)肺癌模型中,厚樸酚及厚樸總酚能預(yù)防肺癌的發(fā)生和發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：厚樸酚 厚樸總酚 去乙�；� TRAIL 非小細(xì)胞肺癌
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-25
• 第一章 前言25-37
• 1.1 肺癌研究概況25-26
• 1.2 肺癌與表觀遺傳學(xué)的研究26
• 1.3 組蛋白去乙�；c肺癌的研究26-27
• 1.4 HDACi與肺癌的研究進(jìn)展27-29
• 1.5 HDACi與細(xì)胞凋亡的研究29-32
• 1.6 HDACi與細(xì)胞周期的研究32-34
• 1.7 厚樸酚與厚樸總酚的抗腫瘤研究34-35
• 1.8 本文研究?jī)?nèi)容和意義35-37
• 第二章 厚樸酚及厚樸總酚抑制NSCLC細(xì)胞的增殖37-47
• 2.1 引言37
• 2.2 材料和方法37-41
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 2.4 小結(jié)與討論45-47
• 第三章 厚樸酚及厚樸總酚對(duì)NSCLC細(xì)胞周期和凋亡的影響47-67
• 3.1 引言47-48
• 3.2 材料和方法48-52
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-64
• 3.4 小結(jié)與討論64-67
• 第四章 厚樸酚及厚樸總酚對(duì)Ⅰ型HDACs基因和蛋白表達(dá)的影響67-90
• 4.1 引言67-68
• 4.2 材料和方法68-79
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-88
• 4.4 小結(jié)和討論88-90
• 第五章 厚樸酚及厚樸總酚作為HDACi阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制90-113
• 5.1 引言90-91
• 5.2 材料和方法91-96
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果96-111
• 5.4 小結(jié)和討論111-113
• 第六章 厚樸酚及厚樸總酚在體內(nèi)的抗肺癌作用與機(jī)制113-131
• 6.1 引言113-114
• 6.2 材料和方法114-118
• 6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果118-129
• 6.4 小結(jié)與討論129-131
• 第七章 結(jié)論與展望131-133
• 7.1 結(jié)論131-132
• 7.2 展望132-133
• 參考文獻(xiàn)133-140
• 英文縮略詞對(duì)照表140-141
• 論文發(fā)表情況141-143
• 致謝143-144

【相似文獻(xiàn)】

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9 莊國(guó)慶;劉青;耿天龍;鄧輝洪;余亞?wèn)|;湯丹;高繼海;羅成榮;;不同海拔高度厚樸的產(chǎn)量及厚樸酚與和厚樸酚含量分析[J];農(nóng)業(yè)與技術(shù);2012年08期

10 歐興長(zhǎng);張玲;席與s，

本文編號(hào)：464494