本文關(guān)鍵詞：逐級(jí)pH-響應(yīng)型多功能納米載藥體系對(duì)肝癌靶向聯(lián)合治療的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的肝細(xì)胞癌(HCC)是臨床上一種最常見(jiàn)的癌癥,化學(xué)治療在HCC的治療中發(fā)揮著重要的作用,但是傳統(tǒng)的化學(xué)治療方法并不能有效的延長(zhǎng)HCC患者的總生存期,這與化療顯著的毒性和耐藥性是緊密相關(guān)的。因?yàn)檠苌稍贖CC的發(fā)展進(jìn)程中起著重要的作用,因此抗血管生成被認(rèn)為是一種很有前景的HCC治療策略。本研究構(gòu)建了一種逐級(jí)p H-響應(yīng)的羧基化改性普魯蘭多糖(CAPL)修飾的β-聚氨基酯(PBAE)/聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米載體系統(tǒng),用于化療藥物紫杉醇(PTX)和血管生成抑制劑康普瑞汀(CA4)的肝癌靶向遞送,以期聯(lián)合化療和抗血管生成治療兩種方法發(fā)揮對(duì)HCC協(xié)同增效的治療作用。內(nèi)容本論文研究的內(nèi)容主要分為以下三部分。第一部分為CAPL包覆的PBAE/PLGA納米粒子(CAPL/PBAE/PLGA)的制備與表征,主要包括CAPL的合成與化學(xué)結(jié)構(gòu)的表征,PBAE/PLGA與CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的制備及其表征。第二部分為CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的體外研究,主要包括p H-響應(yīng)性、電荷翻轉(zhuǎn)能力以及細(xì)胞水平的活性考察等。第三部分為CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的體內(nèi)研究,包括HCC荷瘤小鼠模型的構(gòu)建、體內(nèi)的組織分布考察與抗腫瘤的活性(對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和對(duì)腫瘤血管的抑制活性)的評(píng)價(jià)。方法1.CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的制備與表征:以普魯蘭多糖(pullulan)為原料,通過(guò)兩步化學(xué)反應(yīng)制備羧基化改性普魯蘭多糖(CAPL),并利用p H滴定法、紅外光譜(IR)和核磁共振氫譜(1H NMR)對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征;通過(guò)乳化溶劑揮發(fā)法制備PBAE/PLGA納米核,而后采用共孵育的方法,利用正負(fù)電荷間的相互作用實(shí)現(xiàn)CAPL在疏水PBAE/PLGA納米核表面的包覆,制備CAPL/PBAE/PLGA納米粒子;通過(guò)動(dòng)態(tài)激光散射法和Zeta電位分析儀檢測(cè)納米粒子的粒徑分布和表面荷電性質(zhì);利用透射電鏡(TEM)觀(guān)察納米粒子的結(jié)構(gòu)形態(tài)。2.CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的體外研究:通過(guò)Zeta電位分析儀檢測(cè)CAPL/PBAE/PLGA納米粒子在p H 7.4,7.0與6.5的緩沖液中孵育后Zeta電位的變化,評(píng)價(jià)納米粒子p H-響應(yīng)的電荷翻轉(zhuǎn)能力;制備攜載生物膜熒光染料Dil的納米粒子,并利用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)不同p H值(7.4,7.0與6.5)的培養(yǎng)條件下,CAPL/PBAE/PLGA/Dil納米粒子在人肝癌Hep G2細(xì)胞中的蓄積及胞內(nèi)定位情況,評(píng)價(jià)該納米載體的入胞能力和p H-響應(yīng)性;制備載藥CAPL/PBAE/PLGA/PTX和CAPL/PBAE/PLGA/CA4納米粒子,并通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定載藥量和包封率,評(píng)價(jià)納米載體對(duì)兩種抗腫瘤藥物的攜載能力;采用動(dòng)態(tài)透析法考察載藥納米粒子在p H 7.4,7.0,6.5和5.5緩沖液中的體外釋藥情況,考察納米載體的逐級(jí)p H-響應(yīng)性釋藥特征;利用MTT法檢測(cè)CAPL/PBAE/PLGA/PTX和CAPL/PBAE/PLGA/CA4納米粒子對(duì)Hep G2細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)細(xì)胞的毒性;采用劃痕實(shí)驗(yàn)考察CAPL/PBAE/PLGA/PTX和CAPL/PBAE/PLGA/CA4納米粒子對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移能力的抑制作用。3.CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的體內(nèi)研究:通過(guò)皮下注射Hep G2細(xì)胞構(gòu)建裸鼠肝癌模型;對(duì)CAPL/PBAE/PLGA納米粒子進(jìn)行Cy5.5熒光標(biāo)記,利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)檢測(cè)納米粒子通過(guò)尾靜脈注射給藥后在荷瘤小鼠體內(nèi)的組織分布情況,并以Dil作為模型藥物,考察CAPL/PBAE/PLGA/Dil納米粒子在肝、脾和腫瘤組織中的蓄積情況,綜合評(píng)價(jià)納米載體的肝癌靶向性;尾靜脈注射載藥CAPL/PBAE/PLGA/PTX與CAPL/PBAE/PLGA/CA4納米粒子,考察給藥后荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況;對(duì)治療后小鼠的各器官組織進(jìn)行病理學(xué)檢查,并利用免疫組化方法檢測(cè)腫瘤組織的血管生成情況,綜合評(píng)價(jià)CAPL/PBAE/PLGA納米粒子攜載兩種藥物對(duì)HCC的協(xié)同作用。結(jié)果1.成功合成了CAPL,并通過(guò)IR光譜與1H NMR波譜對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證;成功制備了CAPL/PBAE/PLGA納米粒子,其粒徑大小為178.1 nm,Zeta電位值為 17.8 m V,穩(wěn)定性良好,TEM觀(guān)察具有典型的“核殼結(jié)構(gòu)”;CAPL/PBAE/PLGA納米粒子具有電荷翻轉(zhuǎn)能力,在生理p H值條件下保持穩(wěn)定并帶有負(fù)電性,在弱酸性條件下CAPL分子中的β-酰胺鍵水解游離出正電性的胺基,進(jìn)而介導(dǎo)了PBAE/PLGA納米核的暴露。2.CAPL/PBAE/PLGA納米粒子能夠有效地?cái)y載抗腫瘤藥物PTX與CA4,載藥量分別為8.2%和6.9%;載藥納米粒子中PTX與CA4的體外釋放均呈現(xiàn)顯著的p H-響應(yīng)性,隨著釋放介質(zhì)p H值的降低,PTX和CA4的釋放速率均顯著增加;激光共聚焦和流式細(xì)胞檢測(cè)數(shù)據(jù)也表明CAPL/PBAE/PLGA/Dil納米粒子在Hep G2細(xì)胞中的蓄積具有明顯的p H-選擇性。載藥CAPL/PBAE/PLGA/PTX與CAPL/PBAE/PLGA/CA4納米粒子的聯(lián)合給藥(PTX/CA4)對(duì)Hep G2細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)具有協(xié)同增效的抑制作用,并且能夠顯著抑制HUVEC細(xì)胞的遷移。3.經(jīng)尾靜脈給藥24 h后,CAPL/PBAE/PLGA/Cy5.5納米粒子主要分布于Hep G2荷瘤小鼠的腫瘤組織中,肝臟中也有少量分布。各治療組相比,聯(lián)合給藥后,PTX/CA4納米粒子在PTX 8 mg/kg和CA4 10 mg/kg劑量下表現(xiàn)出對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成較強(qiáng)的抑制作用,并且未造成荷瘤小鼠主要器官組織的病理學(xué)變化。結(jié)論成功制備了能夠?qū)δ[瘤弱酸性微環(huán)境和內(nèi)涵體/溶酶體酸性條件產(chǎn)生逐級(jí)響應(yīng)的CAPL/PBAE/PLGA納米粒子。該納米粒子能有效負(fù)載抗腫瘤藥物PTX與CA4,并且實(shí)現(xiàn)了兩種藥物的p H-響應(yīng)性釋放。在細(xì)胞水平,通過(guò)CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的攜載,PTX/CA4聯(lián)合給藥對(duì)于Hep G2細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制作用,并且顯著抑制了HUVEC細(xì)胞的遷移。在Hep G2荷瘤裸鼠體內(nèi),CAPL/PBAE/PLGA納米粒子表現(xiàn)出良好的肝癌靶向性;PTX/CA4納米粒子聯(lián)合給藥后對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤血管的生成具有協(xié)同抑制作用。綜上所述,CAPL/PBAE/PLGA納米粒子有望作為一種新型藥物載體用于抗腫瘤藥物的HCC靶向傳遞與治療。
【關(guān)鍵詞】：普魯蘭多糖 pH-響應(yīng) PBAE/PLGA 聯(lián)合治療 肝細(xì)胞癌
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R943;R96
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明13-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的制備和表征17-26
• 1.1 對(duì)象和方法17-19
• 1.1.1 材料與儀器17
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-19
• 1.2 結(jié)果19-23
• 1.2.1 AMPL和CAPL的合成與結(jié)構(gòu)確證19-20
• 1.2.2 AMPL中二乙烯三胺基團(tuán)取代度的測(cè)定20-21
• 1.2.3 PBAE/PLGA和CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的制備和表征21-23
• 1.3 討論23-25
• 1.3.1 AMPL和CAPL的合成23-24
• 1.3.2 AMPL中二乙烯三胺基團(tuán)取代度的測(cè)定24-25
• 1.4 小結(jié)25-26
• 二、CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的體外研究26-40
• 2.1 對(duì)象和方法26-28
• 2.1.1 材料與儀器26
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法26-28
• 2.2 結(jié)果28-36
• 2.2.1 CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的p H-響應(yīng)性電荷翻轉(zhuǎn)能力28-29
• 2.2.2 CAPL/PBAE/PLGA/Dil納米粒子在肝癌Hep G2細(xì)胞中的攝取和分布29-31
• 2.2.3 載藥CAPL/PBAE/PLGA/PTX與CAPL/PBAE/PLGA/CA4納米粒子的制備、表征及其載藥與釋藥性能的考察31-34
• 2.2.4 載藥納米粒子在細(xì)胞水平的活性考察34-36
• 2.3 討論36-39
• 2.3.1 CAPL/PBAE/PLGA納米粒子p H-響應(yīng)和電荷翻轉(zhuǎn)能力的研究36
• 2.3.2 CAPL/PBAE/PLGA/Dil納米粒子在Hep G2細(xì)胞中的攝取和分布36-37
• 2.3.3 載藥納米粒子的制備、表征及體外釋藥性質(zhì)的考察37-38
• 2.3.4 PTX/CA4納米粒子的體外聯(lián)合治療作用38-39
• 2.4 小結(jié)39-40
• 三、CAPL/PBAE/PLGA納米粒子的體內(nèi)研究40-48
• 3.1 對(duì)象和方法40-42
• 3.1.1 材料與儀器40
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法40-42
• 3.2 結(jié)果42-46
• 3.2.1 CAPL/PBAE/PLGA納米粒子在Hep G2荷瘤裸鼠中的分布42-44
• 3.2.2 CAPL/PBAE/PLGA納米粒子攜載PTX與CA4治療肝癌的體內(nèi)活性評(píng)價(jià)44-46
• 3.3 討論46-47
• 3.3.1 CAPL/PBAE/PLGA納米粒子在Hep G2荷瘤小鼠體內(nèi)的組織分布46
• 3.3.2 CAPL/PBAE/PLGA納米粒子體內(nèi)抗腫瘤活性的評(píng)價(jià)46-47
• 3.4 小結(jié)47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明54-56
• 附錄56-57
• 綜述 刺激響應(yīng)性腫瘤靶向納米制劑的研究進(jìn)展57-75
• 綜述參考文獻(xiàn)69-75
• 致謝75-76
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷76

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