本文關鍵詞：影響E.coli FtsZ自身組裝及其與MreB相互作用的重要氨基酸分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景由于抗生素的大量使用,細菌產(chǎn)生耐藥性已成為臨床上常見的問題,導致很多的致病菌對抗生素產(chǎn)生抵抗力。抗生素的濫用不僅造成了藥品資源的浪費,還增加了患者的經(jīng)濟負擔,更重要的是使人體菌群失衡免疫力下降并促進耐藥菌株的產(chǎn)生。因此尋找新的抗細菌的藥物靶點、開發(fā)新型藥物相當重要。細菌在分裂和形成子細胞的過程中,需要很多蛋白質(zhì)共同參與。細菌分裂時起必需作用的蛋白對于細菌的生存和增殖是不可缺少的,而且這類蛋白在形態(tài)上很保守并且很難變異,因此成為很有希望的新型抗細菌藥物研發(fā)的靶點。細菌的分裂和特定形態(tài)的維持受多種蛋白的調(diào)節(jié),比如FtsZ、FtsA、ZapA、MreB等,其中微管蛋白類似物FtsZ和肌動蛋白類似物MreB起核心作用,但具體的機制目前未完全清楚,這限制了以FtsZ為靶點進行新一代抗生素的開發(fā)和利用。FtsZ是E.coli等細菌分裂所必需的蛋白,高度保守于原核生物中。FtsZ單體通過縱向和橫向(側(cè)面)相互作用形成束狀聚合物,最后在菌體中部形成Z環(huán)。Z環(huán)的穩(wěn)定需要FtsA、ZipA、ZapA和ZapB等多種蛋白的參與,其最終起骨架作用,通過招募下游與細胞分裂有關的多種蛋白,在即將分裂的菌體細胞中部形成分裂體(divisome),調(diào)控細菌的分裂。分裂體收縮使得分裂蛋白復合物形成隔膜,最后細菌的細胞平均分配母體的遺傳物質(zhì),形成兩個相同的子細胞。MreB是現(xiàn)在公認的控制E.coli形態(tài)的主要蛋白。在真核生物中,生物的形狀和運動性是通過周期性調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架網(wǎng)的聚合和解聚來完成的,而在細菌中,MreB是肌動蛋白類似物,它可以在細胞外圍聚合成細絲,并協(xié)調(diào)細菌細胞壁的合成。其基因敲除后會影響細胞壁的合成,可導致E.coli菌體由桿狀變?yōu)榍驙?但當菌體內(nèi)FtsZ高水平表達,可抑制MreB缺陷所引起的形態(tài)改變。近年來有研究者發(fā)現(xiàn),FtsZ特殊位點氨基酸的突變可致菌體呈馬蹄形、新月形和鹿角形等;另外也有研究者發(fā)現(xiàn),MreB的某些突變體可致細菌的異常分裂,說明FtsZ與MreB間存在某種協(xié)調(diào)關系,但相關機制目前報道較少。為進一步探討FtsZ和MreB是否共同調(diào)控細菌的生長和分裂,通過對不同細菌的FtsZ分析,我們發(fā)現(xiàn)它們氨基酸序列高度同源。本研究以埃希氏大腸桿菌為模式生物,通過分析其FtsZ的三維結(jié)構(gòu)和二維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)E75、R78和D82這三個氨基酸位于FtsZ側(cè)面H3結(jié)構(gòu)域,且可能參與FtsZ(74-82)區(qū)域兩性螺旋結(jié)構(gòu)的形成和FtsZ單體的側(cè)面組裝,而且E75、R78和D82氨基酸位于兩性螺旋結(jié)構(gòu)的同一側(cè)。推測E75、R78和D82可能是影響H3結(jié)構(gòu)和FtsZ胞內(nèi)組裝的重要氨基酸。我們通過對E75、R78和D82特定氨基酸位點進行突變,觀察其對FtsZ胞內(nèi)組裝、定位和FtsZ-MreB相互作用的影響,初步探索相關的作用機制,對以FtsZ為靶點進行新一代抗菌藥物的研發(fā)提供一定的幫助。在我們實驗中,使用活細胞成像技術、免疫沉淀和細菌雙雜交等方法檢測二者可能在調(diào)控細菌的正常生長和分裂中共同發(fā)揮作用。目的探索E.coli FtsZ突變體FtsZE75A、FtsZR78G和FtsZD82A對FtsZ自身組裝和FtsZ-MreB相互作用的影響。方法1.利用常規(guī)分子克隆和定點突變技術,構(gòu)建FtsZ及其突變體表達載體,親和純化后得到相應的目標蛋白。2.通過同源重組構(gòu)建QN6(ftsZ::yfp-cat)、QN7(ftsZE75A::yfp-cat)、QN8(ftsZR78G::yfp-cat)和QN9(ftsZD82A::yfp-cat)菌株。3.利用活細胞成像技術觀察FtsZ及其突變體的胞內(nèi)定位模式。4.免疫沉淀和細菌雙雜交實驗檢測FtsZ/FtsZ*-FtsZ*或FtsZ/FtsZ*-MreB間的相互作用。5.光掃描檢測定點突變后對FtsZ組裝特性的影響。結(jié)果1.FtsZE75A、FtsZR78G和FtsZD82A突變體的功能活性降低、各突變體在E.coli內(nèi)不能正確的定位和形成功能性Z環(huán)。2.FtsZ/FtsZ*-FtsZ*單體間的相互作用減弱或消失,FtsZ*-MreB相互作用破壞。3.FtsZ突變體在體外聚合效率降低。結(jié)論FtsZ E75、R78和D82是影響FtsZ正確組裝和功能及FtsZ-MreB相互作用的重要氨基酸。
【關鍵詞】：大腸埃希氏菌(E.coli) FtsZ組裝 MreB 細胞內(nèi)定位
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R978
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞表12-14
• 引言14-16
• 1 前言16-18
• 2 材料、實驗試劑與儀器18-28
• 2.1 材料與試劑18-19
• 2.2 儀器19-20
• 2.3 部分試劑配制20-28
• 3 實驗方法28-44
• 3.1 質(zhì)粒的提取28
• 3.2 細菌的凍存28-29
• 3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建29-32
• 3.4 細菌基因組DNA的提取32
• 3.5 普通感受態(tài)制備32-33
• 3.6 電穿孔感受態(tài)制備33-34
• 3.7 普通轉(zhuǎn)化34
• 3.8 電穿孔轉(zhuǎn)化34-35
• 3.9 細菌菌體沉淀回收35
• 3.10 菌體細胞的裂解35-36
• 3.11 SDS-PAGE凝膠電泳36
• 3.12 WESTERN BLOT36-37
• 3.13 透析袋的處理37-38
• 3.14 蛋白純化（1ml HP 柱子）38-39
• 3.15 HP柱子再生39
• 3.16 原核蛋白的誘導表達39
• 3.17 OVERLAP PCR39-41
• 3.18 活細胞成像技術41
• 3.19 同源重組法構(gòu)建菌株41
• 3.20 免疫共沉淀41-42
• 3.21 細胞雙雜交試驗42
• 3.22 光掃描法42
• 3.23 平板補償實驗42
• 3.24 生長曲線分析42-44
• 4 實驗結(jié)果44-54
• 4.1 FTSZ突變體位點選擇與設計44
• 4.2 FTSZ及其突變體表達質(zhì)粒的構(gòu)建（詳細構(gòu)建信息見附錄 1）44-46
• 4.2.1 pQN1( P_(lac)-ftsZ )質(zhì)粒的構(gòu)建44-45
• 4.2.2 FtsZ突變體表達質(zhì)粒的構(gòu)建[以pQN2(P_(lac)-fts~(E75A))為例]45-46
• 4.3 同源重組構(gòu)建QN6、QN7、QN8和QN9菌株（構(gòu)建結(jié)果以QN6為例）46-47
• 4.3.1 ftsZ::yfp-cat融合基因片段的制備46
• 4.3.2 QN6(ftsZ::yfp-cat)菌株的構(gòu)建46-47
• 4.4 E75、R78和D82是影響FTSZ在E.COLI中形成Z環(huán)的重要氨基酸47-48
• 4.5 補償實驗驗證FTSZ突變體功能48
• 4.6 E75、R78和D82是影響FTSZ自身組裝的重要氨基酸48-51
• 4.6.1 免疫共沉淀實驗驗證E75、R78和D82是影響FtsZ自身組裝的重要氨基酸48-49
• 4.6.2 構(gòu)建帶His標簽的FtsZ及其突變體融合質(zhì)粒并表達純化49-50
• 4.6.3 光掃描實驗驗證E75、R78和D82是影響FtsZ自身組裝的重要氨基酸50-51
• 4.7 E75、R78和D82位點氨基酸極性改變影響FTSZ-MREB相互作用51-54
• 4.7.1 pUT18C-fts Z表達質(zhì)粒的構(gòu)建（XbaⅠ/BamHⅠ）51-52
• 4.7.2 pKT25-mreB表達質(zhì)粒的構(gòu)建（XbaⅠ/EcoRⅠ）52-53
• 4.7.3 E75、R78和D82位點氨基酸極性改變影響FtsZ-MreB相互作用53-54
• 討論54-56
• 結(jié)論56-58
• 參考文獻58-60
• 綜述60-72
• 參考文獻67-72
• 附錄72-80
• 致謝80-82
• 在讀期間參加的學術會議及研究成果82-83

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 霍雨佳;影響E.coli FtsZ自身組裝及其與MreB相互作用的重要氨基酸分析[D];河南大學;2016年

  本文關鍵詞：影響E.coli FtsZ自身組裝及其與MreB相互作用的重要氨基酸分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：431128