M1和M4是紋狀體內(nèi)主要分布的M受體,在紋狀體MSNs神經(jīng)元發(fā)揮重要的調(diào)控作用,然而具體調(diào)控機(jī)制不清。DARPP-32(Dopamine-and c AMP-regulated phosphoprotein of Mr 32 k Da)是DA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的重要調(diào)控信號(hào)分子之一。在本實(shí)驗(yàn)中,我們證實(shí)了M1和M4對(duì)c AMP/DARPP-32磷酸化信號(hào)通路的調(diào)控作用。給予紋狀體MSNs非選擇性M受體激動(dòng)劑——氧化震顫素(Oxotremorine,OX)1μM,孵育5min后,OX以一種不依賴于M受體的方式升高胞內(nèi)c AMP的水平,與非選擇性DA受體激動(dòng)劑阿撲嗎啡(Apomorphine,APO)比較研究發(fā)現(xiàn)作用弱于阿撲嗎啡。TTX通過(guò)抑制突觸前膜,誘導(dǎo)的胞內(nèi)cAMP生成增加顯著性上調(diào)。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)OX和APO對(duì)DARPP-32的磷酸化具有不同的影響。OX特異性上調(diào)DARPP-32 Thr-75位點(diǎn)的磷酸化,APO同時(shí)上調(diào)DARPP-32 Thr-75和Thr-34位點(diǎn)的磷酸化。特異性敲減M4受體或MT3藥理阻斷M4受體,抑制M受體激動(dòng)導(dǎo)致的Thr75的磷酸化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明M4受體在...

【文章頁(yè)數(shù)】：81 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文縮略詞表
前言
第一部分：Chrm4-sh RNA慢病毒載體的構(gòu)建包裝及KD-M4 MSNs細(xì)胞模型的建立
    一、慢病毒干擾載體的構(gòu)建
        材料與方法
            1 實(shí)驗(yàn)材料
            2 實(shí)驗(yàn)方法
                2.1 sh RNA靶點(diǎn)的選擇
                2.2 sh RNA引物的設(shè)計(jì)
                2.3 RNAi慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        結(jié)果
        小結(jié)
    二、慢病毒的包裝及測(cè)定病毒滴度（吉滿生物）
        材料與方法
            1. 細(xì)胞株
            2. 菌株
            3. 慢病毒包裝系統(tǒng)
            4. 試劑
            5. 儀器
            6. 實(shí)驗(yàn)方法
        結(jié)果
        小結(jié)
    三、KD-M4 MSNs細(xì)胞模型的建立
        材料與方法
            1 實(shí)驗(yàn)材料
            2 實(shí)驗(yàn)方法
                2.1 原代大鼠紋狀體神經(jīng)元培養(yǎng)
                2.2 細(xì)胞免疫熒光
                2.3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)情況
                2.4 Chrm4-sh RNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染紋狀體MSNs
                2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法
        結(jié)果
            1 原代紋狀體 MSN 神經(jīng)元鑒定
            2 Chrm4-sh RNA 慢病毒載體初篩
            3 Chrm4-sh RNA2 慢病毒載體轉(zhuǎn)染 MSNs
        小結(jié)
第二部分：紋狀體MSNs中M4受體對(duì)c AMP/DARPP-32磷酸化信號(hào)通路的調(diào)控作用研究
    材料與方法
        1 實(shí)驗(yàn)材料
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 細(xì)胞免疫熒光
            2.2 應(yīng)用時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法（TR-FRET assay,time-resolved fluoresence resonance energy transfer assay）檢測(cè)原代培養(yǎng)的新生大鼠紋狀體神經(jīng)元胞內(nèi) c AMP 含量
            2.3 大鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi) P-Thr34 Darpp-32，P-Thr75 Darpp-32，CREB 和 P35蛋白含量的測(cè)定（見第一部分實(shí)驗(yàn)方法 2.4）
            2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法
    結(jié)果
        1 M1 和 M4 受體表達(dá)研究
        2 應(yīng)用 TR-FRET 分析檢測(cè)氧化震顫素誘導(dǎo)胞內(nèi) c AMP 生成及調(diào)控作用
        3 氧化震顫素對(duì) DARPP-32 P-Thr34 和 P-Thr75 的磷酸化作用
        4 氧化震顫素上調(diào) DARPP-32 P-Thr75 磷酸化水平的調(diào)控作用研究
        5 在 KD-M4 MSNs 上氧化震顫素對(duì) DARPP-32 P-Thr75 磷酸化作用的研究
    討論
    結(jié)論
圖及照片
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3975287