發(fā)布時(shí)間：2024-05-12 19:13

　　目的為避免西尼羅病毒(WNV)研究中活病毒所帶來(lái)的安全隱患,建立WNV的假病毒報(bào)告系統(tǒng),用于抗WNV藥物的篩選。方法構(gòu)建含有海蜃熒光素酶報(bào)告基因的WNV復(fù)制子重組質(zhì)粒prWNV-Rluc及表達(dá)WNV結(jié)構(gòu)蛋白C、M和E的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CME,并共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,72 h后獲取含有假病毒的培養(yǎng)上清。結(jié)果用上清感染BHK21細(xì)胞后,BHK21細(xì)胞產(chǎn)生熒光,且熒光強(qiáng)度與感染細(xì)胞的假病毒量呈量效關(guān)系。Western印跡法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到感染的BHK21細(xì)胞表達(dá)WNV NS1蛋白,證實(shí)上清中為WN假病毒。中和實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)NV中和性抗體能有效阻斷WN假病毒對(duì)BHK21細(xì)胞的感染。結(jié)論建立了WNV的假病毒報(bào)告系統(tǒng),規(guī)避了生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室(BSL-3)操作,可用于抗WNV藥物的篩選。

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【部分圖文】：

圖2WN假病毒上清對(duì)BHK21細(xì)胞的感染力檢測(cè)

重組質(zhì)粒prWNV-Rluc和pcDNA3.1-CME共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后不同時(shí)間段收取培養(yǎng)上清，10倍稀釋后，感染BHK21細(xì)胞，48h后進(jìn)行熒光素酶的檢測(cè)。繪制動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果顯示（圖3），轉(zhuǎn)染后24～72h，假病毒的感染力呈上升趨勢(shì)，72～96h處于平臺(tái)期，96h后....

圖3西尼羅（WN）假病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)

NS1是WNV的非結(jié)構(gòu)蛋白，WNV感染宿主細(xì)胞后，病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)多輪復(fù)制，產(chǎn)生大量的非結(jié)構(gòu)蛋白。為進(jìn)一步驗(yàn)證獲取的上清的確為WN假病毒，裂解上清感染后的BHK21細(xì)胞，用特異性的抗WNVNS1單抗進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖4），與對(duì)照細(xì)胞相比，上清感染的BHK21細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到....

圖4Western印跡法檢測(cè)WNVNS1蛋白的表達(dá)

圖3西尼羅（WN）假病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)2.5抗體中和實(shí)驗(yàn)

圖5抗體中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

WNV屬于黃病毒屬，可引起人畜共患病，嚴(yán)重可危及生命。隨著WNV感染流行趨于全球化，中國(guó)存在輸入風(fēng)險(xiǎn)。目前，尚無(wú)批準(zhǔn)上市的疫苗以及藥物用于人感染W(wǎng)NV的預(yù)防和治療。因此，針對(duì)WNV的藥物研發(fā)極有必要。中和實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)抗體類藥物抗病毒作用的重要方法，但利用活病毒進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)需要生物安....

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