分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone mediated autophagy,CMA)是一種選擇性自噬,由分子伴侶蛋白特異性地識別并結(jié)合胞質(zhì)中含有KFERQ樣基序(KFERQ-like motif)的蛋白并運(yùn)送至溶酶體中降解。分子伴侶介導(dǎo)自噬通過選擇性降解蛋白分子調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號通路和各種生理過程,幫助細(xì)胞應(yīng)對各種外界刺激和環(huán)境壓力,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)CMA和腫瘤、肥胖、衰老、神經(jīng)退行性等多種疾病密切相關(guān)。比如有研究發(fā)現(xiàn),CMA可以通過調(diào)控腫瘤的糖代謝抑制腫瘤細(xì)胞。已糖激酶Ⅱ(HexokinaseⅡ,HK2)是糖酵解過程中的第一個限速酶,在許多癌細(xì)胞中高度表達(dá),幫助癌細(xì)胞維持生長代謝,是一個潛在的抗癌藥物靶點(diǎn)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)HK2是CMA底物,可以通過誘導(dǎo)分子伴侶介導(dǎo)自噬降解HK2蛋白的水平,破壞腫瘤細(xì)胞的代謝,抑制腫瘤細(xì)胞生長。但是到目前為止,還沒有安全有效的分子伴侶介導(dǎo)自噬誘導(dǎo)化合物,這也制約了分子伴侶介導(dǎo)自噬相關(guān)疾病的藥物開發(fā)。為了尋找具有成藥價值的新型分子伴侶介導(dǎo)自噬誘導(dǎo)化合物,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了HK2-EGFP Tet-on藥物篩選模型,得到了可以穩(wěn)...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．１載體信息??１９??

２．４．３酶切和連接??（１）酶切載體??載體信息如圖２．１。酶切位點(diǎn)為Ｎｃｏ?Ｉ和Ａｇｅ?Ｉ。??（１０，３９６）?Ａｈｄｌ??Ｉ?Ｓｆｉｌ?（１３５２）??ＳＰｅ，（１３Ｓ８）??＾?＾?■－?．ｒ－－?ｎ?＇?＇?ｆｌ?－－；?／?／?．?Ｎｈｅｌ?（１７４３）??（＾ＪＢ....

圖２．２ＨＫ２－ＥＧＦＰＴｅｔ－ｏｎ篩藥模型的構(gòu)建??（Ａ）轉(zhuǎn)染了?ＨＫ２－ＥＧＦＰＴｅｔ－ｏｎ?質(zhì)粒的?２９３Ｔ?經(jīng)?Ｄｏｘ?（１?ｍｇ／ｍｌ?）誘導(dǎo)后，表迖?ＨＫ２－ＥＧＦＰ

圖２．２ＨＫ２－ＥＧＦＰＴｅｔ－ｏｎ篩藥模型的構(gòu)建??（Ａ）轉(zhuǎn)染了?ＨＫ２－ＥＧＦＰＴｅｔ－ｏｎ?質(zhì)粒的?２９３Ｔ?經(jīng)?Ｄｏｘ?（１?ｍｇ／ｍｌ?）誘導(dǎo)后，表迖?ＨＫ２－ＥＧＦＰ。２９３Ｔ??細(xì)胞按照每孔３ｘｌ〇５的細(xì)胞數(shù)量接種于６孔板，次日轉(zhuǎn)染ＨＫ２－ＥＧＦＰＴｅｔ－ｏｎ質(zhì)粒，....

圖２．４?Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ對各種癌細(xì)胞的殺傷性檢測??（Ａ）?Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ對癌細(xì)胞具有殺傷能力

劑盒）對細(xì)胞培養(yǎng)基中的ＡＴＰ進(jìn)行定量測定來檢測培養(yǎng)基中活細(xì)胞數(shù)目的方法，對??實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的癌細(xì)胞系進(jìn)行了?ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ的殺傷性檢測。ＡＴＰ是活細(xì)胞新陳代謝??的一個指標(biāo)，此試劑加入后產(chǎn)生一種“輝光型”的發(fā)光信號，細(xì)胞裂解和產(chǎn)生的??發(fā)光信號與存在的ＡＴＰ量成正比，而ＡＴＰ量....

圖２．５?Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ降低ＨＫ２ＳＳＡ１中ＨＫ２－ＥＧＦＰ的蛋白水平??（Ａ）和（Ｂ）?ＨＫ２ＳＳＡ１中ＨＫ２－ＥＧＦＰ的ＦＩＴＣ－Ａ值隨著ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ濃度增加而降低，并呈濃度??梯度依賴關(guān)系

對ＨＫ２－ＥＧＦＰ?ＦＩＴＣ－Ａ值的降低呈現(xiàn)濃度梯度依賴關(guān)系，隨著ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ作用濃度??的增加，ＨＫ２－ＥＧＦＰ的ＦＩＴＣ－Ａ值隨之降低。并且，利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Ｗｅｓｔｅｒｎ??Ｂｌｏｔ，?ＷＢ）技術(shù)檢測ＨＫ２ＳＳＡ１中ＨＫ２的蛋白水平，如圖２．５所示，隨著ｍｅｔｆｏ....

本文編號：3941308