本文關(guān)鍵詞：亞麻刺盤孢靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化去氫表雄酮工藝及產(chǎn)物分離提取，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：三羥基雄甾烯酮(7α,15α-di OH-DHEA)是合成屈螺酮的重要中間體,而屈螺酮是口服避孕藥“優(yōu)思明”的主要有效成分。采用生物轉(zhuǎn)化法可直接催化去氫表雄酮(DHEA)得到7α,15α-di OH-DHEA。但在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化工藝中,底物的投料濃度和轉(zhuǎn)化效率均較低,從而影響了其工業(yè)過程的經(jīng)濟(jì)性。本論文以實(shí)驗(yàn)室經(jīng)復(fù)合誘變得到的一株能夠轉(zhuǎn)化DHEA的菌株Colletotrichum lini ST-1為研究對(duì)象,通過優(yōu)化工藝條件,建立了靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝,并對(duì)產(chǎn)物的分離提取過程進(jìn)行了優(yōu)化。主要研究工作如下:(1)C.lini ST-1靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化DHEA工藝的建立。通過搖瓶轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,確定了最適轉(zhuǎn)化條件:細(xì)胞濃度12 g·L-1,轉(zhuǎn)化p H 6.5,磷酸鈉緩沖液濃度0.2 M,裝液量30 m L·250 m L-1,轉(zhuǎn)速220 r min-1,溫度30℃。在此條件下,當(dāng)?shù)孜锿读蠞舛葹?0 g·L-1時(shí),產(chǎn)物7α,15α-di OH-DHEA的摩爾得率為38.5%,較生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝提高了21.0%。(2)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中,底物粉碎及助溶工藝的研究。為了進(jìn)一步提高底物轉(zhuǎn)化效率,嘗試了底物粉碎和溶劑助溶兩種方法。結(jié)果表明將底物粉碎后進(jìn)行投料,同時(shí)添加2%的Tween 80,產(chǎn)物的摩爾得率提高到了72.0%。此外,驗(yàn)證了Tween 80的作用機(jī)制,結(jié)果表明添加Tween 80不僅能夠促進(jìn)底物的分散,而且還能增加細(xì)胞膜的通透性。在上述優(yōu)化條件下嘗試采用靜息細(xì)胞進(jìn)行批次轉(zhuǎn)化。經(jīng)過兩批次的轉(zhuǎn)化,在底物累計(jì)投料濃度18 g·L-1時(shí),轉(zhuǎn)化78 h后,7α,15α-di OH-DHEA的摩爾得率為60.5%。(3)在以上工作基礎(chǔ)上,對(duì)轉(zhuǎn)化液中終產(chǎn)物的分離提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,確定了最適的分離提取路線。首先對(duì)轉(zhuǎn)化液的預(yù)處理過程和萃取過程進(jìn)行了優(yōu)化,粗提物收率達(dá)到了95%。然后優(yōu)化了柱層析分離過程,并成功分離得到了目的產(chǎn)物7α,15α-di OH-DHEA。將分離得到的產(chǎn)物用乙酸乙酯進(jìn)行結(jié)晶,產(chǎn)物純度達(dá)到98%,純化的總收率為91.3%。分別采用高效液相色譜、質(zhì)譜、紅外光譜及核磁共振分析鑒定了純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),確定純化后的產(chǎn)物為7α,15α-di OH-DHEA。
【關(guān)鍵詞】：Colletotrichum lini ST-1 去氫表雄酮 三羥基雄甾烯酮 靜息細(xì)胞 生物轉(zhuǎn)化 分離提取
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R914
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 緒論8-16
• 1.1 甾體化合物概述8-9
• 1.1.1 甾體化合物的結(jié)構(gòu)與分類8
• 1.1.2 甾體藥物的現(xiàn)狀8-9
• 1.2 甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化9-13
• 1.2.1 甾體化合物生物轉(zhuǎn)化的發(fā)展歷程9-10
• 1.2.2 甾體化合物生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)類型10
• 1.2.3 甾體化合物的羥基化反應(yīng)10-11
• 1.2.4 甾體化合物羥基化反應(yīng)的機(jī)理11
• 1.2.5 甾體化合物羥基化反應(yīng)的限制因素11-13
• 1.3 去氫表雄酮的羥基化研究13-14
• 1.3.1 去氫表雄酮及其羥基化產(chǎn)物13
• 1.3.2 生物法合成 7α,15α-diOH-DHEA的研究進(jìn)展13-14
• 1.3.3 靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化工藝14
• 1.4 本課題的研究意義14-15
• 1.5 本課題研究的主要內(nèi)容15-16
• 第二章 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝的優(yōu)化16-25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器16-17
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株16
• 2.1.2 培養(yǎng)基16-17
• 2.1.3 主要試劑17
• 2.1.4 主要儀器與設(shè)備17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-19
• 2.2.1 菌體的培養(yǎng)17-18
• 2.2.2 生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化18
• 2.2.3 靜息細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化18
• 2.2.4 靜息細(xì)胞濃度的測(cè)定18
• 2.2.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定18
• 2.2.6 薄層層析（TLC）18
• 2.2.7 高效液相分析（HPLC）18-19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論19-23
• 2.3.1 亞麻刺盤孢生長(zhǎng)曲線19
• 2.3.2 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝的優(yōu)化19-22
• 2.3.3 C. lini ST-1 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化曲線22-23
• 2.3.4 靜息細(xì)胞與生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中各參數(shù)比較23
• 2.4 本章小結(jié)23-25
• 第三章 底物助溶對(duì)C. linli ST-1 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響25-34
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器25
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法25-27
• 3.2.1 菌體的培養(yǎng)25
• 3.2.2 靜息細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化25
• 3.2.3 底物助溶的方法25-26
• 3.2.4 底物溶解性的測(cè)定26
• 3.2.5 靜息細(xì)胞批次轉(zhuǎn)化26
• 3.2.6 菌絲體形態(tài)的觀察26
• 3.2.7 細(xì)胞膜脂肪酸含量的測(cè)定26
• 3.2.8 胞外蛋白濃度的測(cè)定26-27
• 3.2.9 薄層層析（TLC）27
• 3.2.10 高效液相分析（HPLC）27
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論27-33
• 3.3.1 底物的粉碎27
• 3.3.2 底物的助溶27-29
• 3.3.3 Tween 80 助溶效果評(píng)價(jià)29
• 3.3.4 Tween 80 作用機(jī)制驗(yàn)證29-32
• 3.3.5 靜息細(xì)胞的批次轉(zhuǎn)化32-33
• 3.4 本章小結(jié)33-34
• 第四章 產(chǎn)物的分離提取34-45
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器34-35
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株34
• 4.1.2 培養(yǎng)基34-35
• 4.1.3 主要試劑35
• 4.1.4 主要儀器與設(shè)備35
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法35-37
• 4.2.1 轉(zhuǎn)化液的收集35
• 4.2.2 轉(zhuǎn)化液的預(yù)處理35-36
• 4.2.3 產(chǎn)物粗提36
• 4.2.4 產(chǎn)物分離36-37
• 4.2.5 薄層層析（TLC）37
• 4.2.6 高效液相分析（HPLC）37
• 4.2.7 產(chǎn)物的鑒定37
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論37-43
• 4.3.1 產(chǎn)物的粗提37-39
• 4.3.2 柱層析條件的選擇39-42
• 4.3.3 產(chǎn)物的結(jié)晶42
• 4.3.4 分離提純產(chǎn)物的鑒定42-43
• 4.4 本章小結(jié)43-45
• 主要結(jié)論與展望45-47
• 主要結(jié)論45
• 展望45-47
• 致謝47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 附錄 1：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文52-53
• 附錄 2：7α,15α-diOH-DHEA結(jié)構(gòu)鑒定圖譜53-54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：387076