本文關(guān)鍵詞：苛求芽孢桿菌尿酸酶保守序列突變對其性質(zhì)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：苛求芽孢桿菌(ATCC29604)胞內(nèi)尿酸酶含322個殘基,四聚體為活性形式。此尿酸酶在pH 7.4和37℃時半衰期約為23天,比真菌尿酸酶熱穩(wěn)定性高近10倍。分析晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),此尿酸酶N端前9位殘基和C端296到302位殘基以反向β-折疊方式聚攏成二聚體并維持亞基界面上的活性中心,其中N端有堿性和酸性的殘基而C端主要是酸性的殘基。本項目基于尿酸酶構(gòu)象分析、序列比對和定點突變,探索保守序列在酶熱穩(wěn)定性和活性中的作用,為其分子改造奠定基礎(chǔ)。1.苛求芽孢桿菌尿酸酶N端序列對其性質(zhì)的影響野生型N端序列為AERTMFYGKGDV;據(jù)其晶體結(jié)構(gòu),分析附近靜電作用網(wǎng)絡(luò)設(shè)計改變其靜電網(wǎng)絡(luò)的N端突變體。比較發(fā)現(xiàn)N端殘基突變后Ki、Km、最適溫度和最適pH變化較小,但比活性和熱穩(wěn)定性變化不同。野生型尿酸酶比活達(dá)約11.5kU/g,前三個氨基酸的突變ARR、QQR、RQR、VQR的比活分別為6.3kU/g、7.0kU/g、8.6kU/g、 9.3kU/g,非變性PAGE電泳發(fā)現(xiàn)均為四聚體,RER突變體比活提高到13.5kU/g。這些突變體在37℃時熱穩(wěn)定性與野生酶基本一致,4℃pH9.2時穩(wěn)定性略有下降。但突變體RESRESRER、REGREGRER、 SSSSSRER比活性下降到4.3kU/g、2.7kU/g、4.8kU/g,經(jīng)非變性PAGE電泳發(fā)現(xiàn)仍為四聚體,且熱穩(wěn)定性在37℃pH 7.4變化顯著,分別為1.3d,0.75d,16d。最特別的是突變體Y7F,其比活能保留27%,但在37℃中性條件熱失活加速1000倍。2.苛求芽孢桿菌尿酸酶C端序列對其性質(zhì)的影響對C端305位以后殘基突變或者截斷或延長C端考察性質(zhì)改變。突變體D307R、去307都沒有活性,突變體去314、R310E、R311R、 E318R、Y319F、L322R分別為3.2kU/g.4.4kU/g、3.6kU/g、3.3kU/g、 2.9kU/g、3.6kU/g,均為四聚體；中性條件下37℃熱穩(wěn)定性明顯下降但堿性條件穩(wěn)定性變化小。突變體L322SNSNSN、L322DSNSNSN、 L322DSNSNSNHHHHHH表達(dá)之后經(jīng)DEAE-纖維素、制備型電泳純化后最高比活保留66%,且熱穩(wěn)定性基本不變。無論C端還是N端加入His標(biāo)簽后比活性都會下降,但熱穩(wěn)定性影響不大,用Ni2+-NTA純化效果與DEAE-纖維素接近,但效率高很多。3.苛求芽孢桿菌尿酸酶中間保守區(qū)突變對其性質(zhì)的影響。序列比對發(fā)現(xiàn)在此尿酸酶中間也有保守序列。其中A68L、T69V、 D70L、K73E、F179L、D185N、S243A、I244F、Q245I、H246E均無活性,非變性PAGE電泳觀察表達(dá)產(chǎn)物主要為二聚體；F179L為四聚體卻仍無活性。突變體D70N、S71A、T188V、T189V、E192Q、Y249F、 F298L、Q299I、F301L的活性分別為0.55kU/g、0.34kU/g、 0.65kU/g、 0.53kU/g、1.85kU/g、4.71kU/g、1.97kU/、0.93kU/g、2.59kU/g;突變體D70N為二聚體,但有活性。在37℃和4℃及pH 7.4和pH 9.2時,這些突變體熱穩(wěn)定性均顯著下降,其中D70N、T188V、E192Q熱失活半衰期只為原來的0.1%。4.苛求芽孢桿菌尿酸酶亞基之間離子鍵改變對其性質(zhì)的影響在此尿酸酶四聚體晶體結(jié)構(gòu)中,每個二聚體中每個亞基的R140、 E142、E291、R293與另一個二聚體中對應(yīng)相鄰亞基的E142、R140、R293和E291形成四對離子鍵；據(jù)此兩個二聚體間形成八對離子鍵。突變體R140E、R140Q、E142R、E291Q、E291R中,E142為四聚體無活性,其余活性為1.3kU/g、1.6kU/g、13.3kU/g、0.1kU/g; E291Q活性較高但穩(wěn)定性最差。突變體N141C、P292C能形成二硫鍵,但不能提高穩(wěn)定性。這7個突變體與氧嗪酸鉀結(jié)合,在相應(yīng)條件下的熱穩(wěn)定性都可以顯著提高,最強(qiáng)的增強(qiáng)效應(yīng)達(dá)到數(shù)百倍。5.苛求芽孢桿菌尿酸酶序列和性質(zhì)關(guān)系此尿酸酶及其突變體解聚失活后,抑制劑氧嗪酸和黃嘌呤及底物尿酸可誘導(dǎo)聚合再組裝成活性四聚體。此尿酸酶C端有獨特構(gòu)象且C端參與形成的靜電網(wǎng)絡(luò)、保守序列間氫鍵都是活性和穩(wěn)定性所必須；四聚體內(nèi)部相鄰亞基之間的離子鍵也是維持活性四聚體的關(guān)鍵。在低溫下,此尿酸酶初期非常穩(wěn)定,但構(gòu)象變化積累到一定程度后活性快速指數(shù)衰減,呈現(xiàn)明顯的兩階段失活過程。總體而言,此尿酸酶有優(yōu)異熱穩(wěn)定性,可能是此尿酸酶長期進(jìn)化效應(yīng)積累所致。
【關(guān)鍵詞】：苛求芽孢桿菌尿酸酶 保守序列定點突變 熱穩(wěn)定性 組氨酸標(biāo)簽
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R915
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-18
• 參考文獻(xiàn)16-18
• 第一部分 苛求芽孢桿菌尿酸酶N端序列對其性質(zhì)的影響18-31
• 1 材料與方法18-21
• 2 實驗方法21-25
• 3 結(jié)果25-30
• 4 本部分小結(jié)30-31
• 第二部分 苛求芽孢桿菌尿酸酶C端序列對其性質(zhì)的影響31-37
• 1 材料與方法31
• 2 實驗方法31-32
• 3 結(jié)果32-35
• 4 本部分小結(jié)35-37
• 第三部分 苛求芽孢桿菌尿酸酶中間保守區(qū)突變對其性質(zhì)的影響37-45
• 1 材料與方法37
• 2 實驗方法37-38
• 3 結(jié)果38-44
• 4 本部分小結(jié)44-45
• 第四部分 苛求芽孢桿菌尿酸酶離子鍵對其性質(zhì)的影響45-52
• 1 材料與方法45
• 2 實驗方法45
• 3 結(jié)果45-51
• 4 本部分小結(jié)51-52
• 全文總結(jié)52-53
• 致謝53-54
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文54

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 林聽寶;;測定血清和尿液中尿酸的新的酶促法[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊;1982年01期

2 劉廣楨,陳建華,王e，

本文編號：386013