本文關(guān)鍵詞：尺寸可控的順鉑載藥膠束的制備、表征及抗腫瘤活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：順鉑(CDDP)是腫瘤臨床治療的一線藥物,但它的肝臟和腎臟毒性限制了其在臨床應用。納米藥物載體為CDDP在治療腫瘤中的應用提供了新思路,可通過主動或者被動靶向提高CDDP在腫瘤組織中滯留,降低毒副作用。但是,納米藥物也存在一些缺陷,如：較差的穩(wěn)定性、沒有持久的藥物釋放能力、較低的載藥率等；此外,納米藥物的尺寸效應與腫瘤治療效果之間的關(guān)系也研究甚少。因此,一種更有效的尺寸可控的CDDP納米載藥系統(tǒng)亟待發(fā)展。本課題基于γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的納米膠束是一種新型可降解的納米材料,γ-PGA分子兩側(cè)有大量親水性羧基基團,通過脫水縮合反應將具有疏水基團的苯丙氨酸(Phe)接入γ-PGA側(cè)鏈,在水相中所形成的納米膠束由內(nèi)部的疏水基團(苯環(huán))和外部的親水基團(羧基)組成。通過調(diào)節(jié)γ-PGA分子量,利用納米膠束疏水基團形成的內(nèi)部空腔和納米膠束表面裝載或絡(luò)合藥物CDDP,制備和表征了兩種納米尺寸的納米藥物M(Pt):M(Pt)-1和M(Pt)-2。進一步比較了兩種納米尺寸藥物M(Pt)在細胞水平和動物水平抑制腫瘤的效果。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：1.M(Pt)的制備,表征和性質(zhì)研究本文通過高溫酸解法(PH=3.0,98℃)調(diào)節(jié)γ-PGA分子量,成功制備出了尺寸可控的γ-PGA納米膠束。我們制備出了兩種有明顯尺寸差別的γ-PGA納米膠束(106.3±11nm和221.3±18nm),它們所對應的γ-PGA的分子量分別是100KD與50KD。兩種尺寸的納米藥物M(Pt)-1和M(Pt)-2對CDDP的裝載率均比一般的CDDP藥物載體的載藥率要高出20%左右；M(Pt)-1與M(Pt)-2均有較好的穩(wěn)定性,在室溫條件下可穩(wěn)定存在一周；在10%新鮮血清的生理鹽水中,納米藥物M(Pt)在連續(xù)7天的累計釋放CDDP的量達到70%左右,表明M(Pt)具有較好的緩釋能力。2.M(Pt)的體外生物學活性本文比較了較小尺寸(100nm)納米藥物M(Pt)-1,與較大尺寸(200nm)納米藥物M(Pt)-2對三種腫瘤細胞：HeLa, B16F10和A549的殺傷效率。納米藥物M(Pt)對三株細胞的致死能力為HeLaB16F10A549。M(Pt)-1對三株細胞在48h的IC50依次為：4.97±0.8μg/ml,6.94±0.89μg/ml,14.53±1.09μg/ml; M(Pt)-2對三株細胞在48h的IC50依次為：10.63±2.2μg/ml,11.20±1.12μg/ml, 19.99±1.42μg/ml。FITC熒光標記的M(Pt)-1,M(Pt)-2與HeLa細胞分別孵育15min、 30min、60min,熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果如下：(1)M(Pt)-1組與M(Pt)-2組細胞表面的熒光強度均具有時間依賴性,孵育時間越久細胞表面熒光強度越高；(2)M(Pt)-1組細胞較M(Pt)-2組細胞熒光強度高；(3)M(Pt)-2組與M(Pt)-1組細胞相比,熒光多數(shù)聚集在細胞表面。以上研究結(jié)果表明,納米藥物M(Pt)仍保留了對腫瘤細胞的致死能力,100nm左右的小尺寸M(Pt)-1能更快的被細胞攝取。3.M(Pt)的體內(nèi)生物學活性以4mg/kg的M(Pt)-1,M(Pt)-2藥物劑量,連續(xù)7天尾靜脈注射健康KM鼠,以空載y-PGA納米膠束為對照,觀察納米藥物M(Pt)在小鼠體內(nèi)的累積毒性。在注射的第5天,實驗組小鼠的體重開始明顯下降,表明100nm的M(Pt)-1和200nm的M(Pt)-2在體內(nèi)的累積會造成一定的累積毒性；25天的統(tǒng)計結(jié)果顯示兩種尺寸藥物M(Pt)處理組之間無明顯差異,同時小鼠的體重得到了恢復。我們進一步比較了M(Pt)-1與M(Pt)-2體內(nèi)的抗腫瘤能力,在抑制B16-F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移中,M(Pt)-1組小鼠肺組織的轉(zhuǎn)移灶少于M(Pt)-2實驗組。在抑制HeLa腫瘤增殖的實驗中,M(Pt)-1組腫瘤體積小于M(Pt)-2組小鼠腫瘤體積,且兩組腫瘤體積有顯著性差異(P0.05),20天后的M(Pt)-1組和M(Pt)-2組腫瘤體積變化的平均值分別為207.42和347.18。以上結(jié)果表明,M(Pt)-1較M(Pt)-2有更好的腫瘤治療效果。CDDP,M(Pt)-1與M(Pt)-2在血液循環(huán)周期中的檢測結(jié)果如下：(1)CDDP很快被血液循環(huán)清除,10h后血液中Pt含量僅為500ng Pt/mL;(2)相比而言,納米藥物M(Pt)血液循環(huán)周期更長,10h后血液中的含量約為3000ng Pt/mL。組織分布結(jié)果顯示,10h后M(Pt)-1組小鼠在腫瘤組織中的Pt含量也較M(Pt)-2組小鼠高,平均滯留量(n=3)分別為20.55和8.28ng/mg tissue。M(Pt)-1組中肝臟,腎臟,脾臟,心臟和肺中Pt的含量與腫瘤組織中的含量的比值分別為：1.07,0.60,0.64,0.55,0.67；在M(Pt)-2組中肝臟,腎臟,脾臟,心臟和肺中Pt的含量與腫瘤組織中的含量的比值分別為：2.11,1.54,1.43,0.48,0.78。以上M(Pt)-1與M(Pt)-2的對比結(jié)果表明,在小鼠體內(nèi)10Onm的M(Pt)-1有更好的腫瘤組織滯留效果；在小鼠體內(nèi)的相對毒性數(shù)值表明M(Pt)-1有更低的肝腎毒性損傷。綜上所述,本研究所制備的納米藥物M(Pt),具有尺寸可控,穩(wěn)定性好,緩釋能力強,對CDDP的載藥量高等優(yōu)勢,有較好臨床應用前景；本研究結(jié)果表明100nm的M(Pt)-比200nm的M(Pt)-1有更好的腫瘤治療效果,M(Pt)-1在腫瘤組織中比M(Pt)-2有更高的滯留量,本文將為開發(fā)治療腫瘤疾病的納米藥物提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：γ-聚谷氨酸納米膠束 順鉑 抗腫瘤效果 尺寸效應 組織分布
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943;R96
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-15
• 第一章 緒論15-26
• 1. 引言15-17
• 2. 納米藥物載體的研究進展17-22
• 2.1 無機納米顆粒及有機納米顆粒17-18
• 2.2 多功能納米顆粒的研究18-21
• 2.3 對納米顆粒結(jié)構(gòu)的研究21-22
• 3. 聚谷氨酸偶聯(lián)抗腫瘤藥物CDDP的研究22-24
• 4. 本論文研究的目的和意義24-26
• 第二章 納米藥物M(Pt)的合成與表征26-49
• 1. 引言26-27
• 2. 實驗儀器與試劑27-29
• 2.1 實驗儀器27
• 2.2 實驗試劑27-28
• 2.3 溶液配制28-29
• 3. 實驗方法29-32
• 3.1 基于γ-PGA納米膠束的制備及鑒定29-31
• 3.1.1 不同分子量γ-PGA的制備29
• 3.1.2 γ-PGA納米膠束的制備29-30
• 3.1.3 γ-PGA-PAE納米材料的核磁鑒定30
• 3.1.4 DLS法檢測γ-PGA納米膠束的納米尺寸30
• 3.1.5 TEM分析γ-PGA納米膠束的形態(tài)表征30
• 3.1.6 Nanosight檢測γ-PGA納米膠束濃度及粒徑30-31
• 3.2 M(Pt)的合成及表征31-32
• 3.2.1 M(Pt)的制備31
• 3.2.2 檢測M(Pt)的裝載率31
• 3.2.3 M(Pt)的UV-Vis光譜掃描31-32
• 3.2.4 M(Pt)的穩(wěn)定性32
• 3.2.5 M(Pt)的體外釋放32
• 4. 實驗結(jié)果32-46
• 4.1 不同分子量的γ-PGA的制備32-33
• 4.2 L-PAE不同接入率的TEM表征33-35
• 4.3 DLS法對M(Pt)尺寸的表征35-37
• 4.4 TEM對納米藥物M(Pt)形態(tài)的分析37
• 4.5 利用NanoSight分析M(Pt)37-40
• 4.6 γ-PGA-PAE的核磁表征40-41
• 4.7 M(Pt)裝載CDDP的檢測41-42
• 4.8 對M(Pt)穩(wěn)定性的探究42-43
• 4.9 M(Pt)的體外釋放43-45
• 4.10 M(Pt)的UV-Vis的光譜掃描45-46
• 5. 討論46-49
• 第三章 納米藥物M(Pt)的體外生物學活性49-62
• 1. 引言49
• 2. 實驗材料與試劑49-51
• 2.1 實驗細胞49
• 2.2 實驗儀器及耗材49-50
• 2.3 實驗試劑50
• 2.4 緩沖液及培養(yǎng)基的配置50-51
• 3. 實驗方法51-54
• 3.1 細胞的培養(yǎng)51-53
• 3.1.1 細胞傳代51-52
• 3.1.2 細胞復蘇與凍存52-53
• 3.2 檢測γ-PGA納米膠束的安全性53
• 3.3 對M(Pt)的細胞毒性檢測53-54
• 3.4 HeLa細胞對M(Pt)攝取能力的檢測54
• 4. 結(jié)果分析54-60
• 4.1 M(Pt)對腫瘤細胞的抑制54-56
• 4.2 HeLa細胞對M(Pt)的攝取能力分析56-60
• 5. 討論60-62
• 第四章 納米藥物M(Pt)的體內(nèi)生物學活性62-89
• 1. 引言62
• 2. 實驗相關(guān)材料62-64
• 2.1 實驗所用細胞62
• 2.2 實驗動物及飼養(yǎng)條件62-63
• 2.3 主要實驗儀器及耗材63
• 2.4 實驗試劑63-64
• 2.4.1 分子生物學試劑63
• 2.4.2 細胞培養(yǎng)基63-64
• 3. 實驗方法64-71
• 3.1 M(Pt)的急性毒性實驗64-65
• 3.2 建立小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型65
• 3.3 建立HeLa腫瘤裸鼠模型65-66
• 3.4 血清生化指標分析66
• 3.5 組織切片及HE染色66-69
• 3.6 M(Pt)的血液循環(huán)周期69-70
• 3.7 M(Pt)的組織分布70-71
• 4. 結(jié)果分析71-86
• 4.1 M(Pt)的體內(nèi)急性毒性分析71-74
• 4.2 血清指標的檢測結(jié)果74-76
• 4.3 M(Pt)抑制黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移分析76-79
• 4.4 M(Pt)抑制腫瘤生長的活性分析79-83
• 4.5 裸鼠肝臟、脾臟、腎臟的HE染色分析83-84
• 4.6 M(Pt)在體內(nèi)的代謝及組織分布的分析84-86
• 5. 討論86-89
• 第五章 全文總結(jié)89-92
• 附錄92-93
• 參考文獻93-98
• 致謝98

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