斷裂內(nèi)含肽Npu DnaE介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接、剪切反應(yīng),可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域諸多方面,但其C段重組蛋白在表達(dá)純化過(guò)程中發(fā)生的降解,降低了重組蛋白的產(chǎn)率和純度。為提高NpuC段穩(wěn)定性,本研究構(gòu)建了N端融合NpuN2片段的NpuC延長(zhǎng)變體N2C。將N2C在BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)、用親和色譜進(jìn)行純化,用ImageJ掃描計(jì)算表達(dá)純化中降解情況,進(jìn)而對(duì)影響內(nèi)含肽C端剪切反應(yīng)的各因素如溫度、DTT濃度、N/C比例等進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,延長(zhǎng)變體N2C使降解產(chǎn)物占比降低至2. 7%～7. 2%,在1 mmol/L DTT催化,N/C比例為5∶1,37℃反應(yīng)條件下,30 min產(chǎn)物生成率達(dá)90%。N2C在提升Npu DnaE內(nèi)含肽C段在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)、純化過(guò)程的穩(wěn)定性的同時(shí),保留了其C端剪切反應(yīng)的活性,對(duì)其在蛋白純化領(lǐng)域應(yīng)用有重要意義。

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料
    1.1 試劑
    1.2 儀器
    1.3 菌株和質(zhì)粒
2 方法
    2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        2.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.2 重組蛋白的親和純化
    2.3 N2C的C端剪切反應(yīng)
        2.3.1 Western blot和SDS-PAGE檢測(cè)N2C的C端剪切反應(yīng)
        2.3.2 影響N2C的C端剪切反應(yīng)因素
3 結(jié)果
    3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    3.2 Npu C段重組蛋白在表達(dá)純化過(guò)程中的降解情況
    3.3 N2C的C端剪切反應(yīng)
        3.3.1 Western blot檢測(cè)N2C的C端剪切反應(yīng)
        3.3.2 SDS-PAGE檢測(cè)N2C的C端剪切反應(yīng)
        3.3.3 影響N2C的C端剪切反應(yīng)的因素
4 討論



本文編號(hào)：3837583