本文關(guān)鍵詞：可解離的人胰高血糖素樣肽-1與人血清白蛋白融合蛋白的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胰高血糖素樣肽-1是在腸L細(xì)胞中分泌的一種由30個(gè)氨基酸殘基組成的功能短肽。它具有葡萄糖依賴性的促進(jìn)胰島素分泌、減慢胃的排空、減少食物攝取、以及抑制胰高血糖素的分泌、刺激胰島B細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡等多種功能。GLP-1通過與胰島B細(xì)胞上的GLP-1受體相結(jié)合,使后者以葡萄糖依賴的方式分泌胰島素。II型糖尿病人常常表現(xiàn)為GLP-1分泌受損,而人體胰島B細(xì)胞對GLP-1的反應(yīng)往往是正常的,因此GLP-1在治療II型糖尿病方面具有良好的應(yīng)用前景。但是,機(jī)體本身產(chǎn)生的有活性的GLP-1很容易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)降解而失去活性,同時(shí)很容易從腎臟排出體外,故其生物半衰期僅為2-6min,這在很大程度上限制了其臨床應(yīng)用與療效。小分子蛋白類藥物的長效化改造通常是將其與具有較長半衰期的人血清白蛋白或聚乙二醇相結(jié)合。然而由于HSA的空間位阻效應(yīng),傳統(tǒng)的人血清白蛋白融合技術(shù)在改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的同時(shí)往往伴隨著藥效動(dòng)力學(xué))性質(zhì)的下降。本項(xiàng)研究中通過在GLP-1和HSA之間插入能夠被弗林蛋白酶(furin)切割的多肽序列,使得GLP-1在體內(nèi)以可控和靶向的方式被釋放,同時(shí)將其序列中的第二位Ala替換為Gly,阻止DPP-IV的降解,恢復(fù)其生物學(xué)活性,從而在藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)性質(zhì)之間達(dá)到平衡,使其發(fā)揮最大療效。本研究的目標(biāo)在于構(gòu)建四種在體內(nèi)以不同速率解離的人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)與人血清白蛋白融合蛋白,進(jìn)一步考察各種融合蛋白的療效與其解離速率之間的關(guān)系,獲得在藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)之間保持最佳平衡的融合蛋白。所用到的方法及結(jié)論主要有：1、通過多步PCR擴(kuò)增出具有不同解離速率的融合蛋白的全部基因,將其克隆到表達(dá)載體pPIC9,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115,經(jīng)過甲醇誘導(dǎo),分泌表達(dá)各種GLP-1與HSA融合蛋白,并將各種融合蛋白分離純化后進(jìn)行初步藥代學(xué)和藥效學(xué)研究。2、通過將各種融合蛋白樣品與furin共同孵育后,其酶切產(chǎn)物用Western印跡法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,不可解離的融合蛋白在furin的作用下未發(fā)生解離,而可解離的融合蛋白Gly2-GLP-1-VTR-HSA為慢解離,Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA為中等速率解離,Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA為快解離。3、通過在不同濃度的葡萄糖環(huán)境下,用各種融合蛋白刺激MIN6細(xì)胞分泌胰島素,檢測分泌量的變化方法來確定各融合蛋白的體外生物學(xué)活性。結(jié)果表明,在高糖(25mM)和低糖(0.5mM)環(huán)境下,Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA,Gly2-GLP-1-VTR-HSA,Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA和Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA組胰島素釋放量均高于空白對照組,差異極顯著；而融合蛋白之間的胰島素釋放量無顯著性差異。4、通過皮下注射100μg的各種融合蛋白,于不同時(shí)間點(diǎn)通過尾靜脈取血,利用雙抗體夾心法Elisa進(jìn)行檢測血清中融合蛋白的濃度來確定各種融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明各種融合蛋白在體內(nèi)的半衰期大小依次為Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA、Gly2-GLP-1-VTR-HSA、Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA、Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA。5、將實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔單獨(dú)注射葡萄糖后,立即皮下注射生理鹽水和不同融合蛋白的(40nmol/kg)供試樣品。于不同時(shí)間點(diǎn)取血,測定血糖濃度來評價(jià)各種融合蛋白的體內(nèi)藥效動(dòng)力學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明各種融合蛋白均表現(xiàn)出降糖活性,且其活性高低依次為Gly2-GLP-1-VTR-HSA、Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA、Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA、Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA。本研究中引入蛋白酶切割位點(diǎn)后,GLP-1可以在體內(nèi)從融合蛋白中解離出來,使其恢復(fù)生物學(xué)活性。只有控制融合蛋白在體內(nèi)適當(dāng)?shù)慕怆x速率才能達(dá)到最佳的療效,從而在藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)性質(zhì)之間達(dá)到平衡。本項(xiàng)研究利用可解離的人血清白蛋白融合技術(shù)將為長效蛋白藥物開發(fā)中面臨的藥效動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)之間的矛盾提供一種有效的解決途徑。同時(shí),本項(xiàng)研究中構(gòu)建的GLP-1與HSA的融合蛋白還將為創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：胰高血糖素樣肽-1 人血清白蛋白 藥效動(dòng)力學(xué) 藥代動(dòng)力學(xué)
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 符號說明11-12
• 第一章 前言12-24
• 1 糖尿病的概述12-14
• 1.1 糖尿病的分類12-13
• 1.2 糖尿病的發(fā)病機(jī)制13
• 1.3 糖尿病的治療策略13-14
• 2 GLP-1簡介14-20
• 2.1 GLP-1的合成、分泌和降解14-15
• 2.2 GLP-1的生物學(xué)作用15-17
• 2.3 GLP-1類藥物的研究進(jìn)展17-20
• 3 可解離的人血清白蛋白融合技術(shù)20-22
• 3.1 人血清白蛋白技術(shù)20-21
• 3.2 可解離的人血清白蛋白融合技術(shù)21-22
• 4 研究意義22
• 5 研究內(nèi)容22-24
• 第二章 人胰高血糖素樣肽-1和人血清白蛋白融合蛋白載體的構(gòu)建與表達(dá)24-56
• 1 實(shí)驗(yàn)材料24-28
• 1.1 菌種及質(zhì)粒24-25
• 1.2 主要生化和分子生物學(xué)試劑25
• 1.3 主要培養(yǎng)基及緩沖液配制25-27
• 1.4 主要儀器27-28
• 2 實(shí)驗(yàn)方法28-49
• 2.1 各種人胰高血糖素樣肽-1和人血清白蛋白融合蛋白基因的克隆28-36
• 2.2 基因片段連接pEASY-Blunt載體36-38
• 2.3 各種人胰高血糖素樣肽-1和人血清白蛋白融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建38-44
• 2.4 各種表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株以及目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)44-47
• 2.5 各種畢赤酵母重組菌的搖瓶培養(yǎng)47
• 2.6 目的蛋白的分離純化47-48
• 2.7 Lorry法測定蛋白濃度48-49
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-53
• 3.1 各種融合蛋白基因的克隆49
• 3.2 各種融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定49-50
• 3.3 轉(zhuǎn)化子的菌液PCR鑒定50-51
• 3.4 各種融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)51-52
• 3.5 融合的蛋白的分離純化52-53
• 4 討論53-56
• 第三章 融合蛋白的體外評價(jià)56-64
• 1 實(shí)驗(yàn)材料57-58
• 1.1 細(xì)胞株57
• 1.2 主要試劑57
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器57-58
• 2 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 2.1 融合蛋白的體外解離實(shí)驗(yàn)58
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)58
• 2.3 融合蛋白體外生物學(xué)活性的測定58-59
• 2.4 胰島素含量的測定59
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-62
• 3.1 融合蛋白體外解離實(shí)驗(yàn)59-61
• 3.2 融合蛋白體外生物學(xué)活性的測定61-62
• 4 討論62-64
• 第四章 融合蛋白的體內(nèi)評價(jià)64-70
• 1 實(shí)驗(yàn)材料64-65
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物64
• 1.2 主要試劑64
• 1.3 主要儀器64-65
• 2 實(shí)驗(yàn)方法65-66
• 2.1 血漿藥物濃度—時(shí)間曲線的測定65-66
• 2.2 口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(OGTT)66
• 2.3 長效降糖活性的檢測66
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-68
• 3.1 血漿藥物濃度—時(shí)間曲線的測定66-67
• 3.2 口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)67-68
• 3.3 長效降糖活性的檢測68
• 4 討論68-70
• 第五章 結(jié)論與展望70-72
• 1 主要結(jié)論70
• 2 存在的問題及展望70-72
• 參考文獻(xiàn)72-80
• 致謝80-82
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、專利及參加的會(huì)議82

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1 顏衛(wèi)華,范麗安;KIR2DL4-IgFc融合蛋白基因真核細(xì)胞表達(dá)載體的克隆及鑒定分析[J];免疫學(xué)雜志;2002年03期

2 范瑋,李卓婭,龔非力,姜曉丹,馮瑋;人類可溶性TNFRⅠ-GFP融合蛋白重組體的構(gòu)建、表達(dá)和特性分析[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年02期

3 李詠梅;楊海文;羅仁;;人表皮生長因子-天花粉蛋白融合蛋白的基因克隆、表達(dá)及純化[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年02期

4 馬海智;王秦秦;;融合蛋白在腫瘤研究中的應(yīng)用[J];腫瘤防治研究;2007年05期

5 張新國;王婧;閆璐穎;唐莉;陳建華;王e，

本文編號：383701