本文關(guān)鍵詞：聚精氨酸修飾的酸敏感脂質(zhì)體的構(gòu)建和評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:腫瘤靶向制劑已成為近幾年治療癌癥的研究熱點,此種制劑可以將藥物盡可能多的輸送到靶組織,進而發(fā)揮藥物的治療作用。脂質(zhì)體具有類似生物膜的結(jié)構(gòu),作為納米給藥制劑的一種非病毒載體,因其具有低的免疫原性、低毒性以及靶向性等優(yōu)點,已廣泛作為腫瘤靶向制劑的重要載體。但是,脂質(zhì)體仍然存在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除、穩(wěn)定性差、攝取效率低等問題,因此,設(shè)計一種修飾后的改良脂質(zhì)體對生物大分子有效輸送到靶器官具有重要意義。本研究構(gòu)建了三種具有不同功能性脂材的PEG化脂質(zhì)體:普通載藥脂質(zhì)體NL、CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL。并對三種脂質(zhì)體進行電位和粒徑的表征,以MCF-7和A549細胞為模型細胞,對不同脂質(zhì)體與細胞作用特點進行考察。方法:1琥珀酰亞胺基-對甲�；郊姿峒柞�(SFB)和3-馬來酰亞胺基丙酸酰肼(MPH)分別制備儲備液,充氮氣,室溫攪拌,旋蒸揮去有機溶劑,得干燥的黃色固體S-M。2自制的S-M與DSPE-PEG-NH2分別溶解,室溫充氮氣攪拌,得中間體DSPE-PEG-Hz。3取CPP樣品管,室溫平衡30min溶解,加入到DSPE-PEG-Hz溶液中,充氮氣,室溫避光反應(yīng)48h,旋蒸揮干有機溶劑,得黃色目標產(chǎn)物DSPE-PEG-Hz-CPP。4構(gòu)建普通載藥脂質(zhì)體NL、CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL,并用馬爾文粒度儀進行粒徑和電位的表征。操作方法如下:分別以SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG、SPC/DC-chol/Chol/DSPEPEG/DSPE-PEG-CPP、SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG/DSPE-PEG-Hz-CPP為脂材旋轉(zhuǎn)成膜,加DEPC水(含si RNA 3.75nmol),手搖水化脫膜,水浴超聲,得半透明體系NL、CL、CHL。5用流式細胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡分析經(jīng)NL、CL、CHL處理的MCF-7和A549細胞,流式分析以胞內(nèi)平均熒光強度考察指標,評價細胞攝取效率。激光共聚焦顯微鏡清楚地顯示了三種制劑輸送si RNA至細胞中的位置。6用激光共聚焦顯微鏡分析經(jīng)CL、CHL處理的A549細胞,觀察si RNA是否從內(nèi)涵體中逃逸,發(fā)揮基因沉默效應(yīng)。結(jié)果:1合成S-M:黃色固體粉末,質(zhì)譜圖中m/z=413.36,與S-M理論計算值413.36(M+H+)相符,證明產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確。2合成DSPE-PEG-Hz:中間體平均離子峰為3103.41,與理論設(shè)計肽平均分子量相符,證明產(chǎn)物中有目標中間體。3合成DSPE-PEG-Hz-CPP:產(chǎn)物平均分子離子峰為4611.08,與理論設(shè)計肽平均分子量相符,證明合成了目標產(chǎn)物。但是質(zhì)譜圖中可看到一個平均分子量為2832.19的雜峰,為第二步的原料DSPE-PEG-NH2,產(chǎn)物合成的方法以及純化的步驟還需改進。4載藥普通脂質(zhì)體NL、CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL粒徑和電位測得結(jié)果如下:NL、CL、CHL的平均粒徑分別為124.9nm、145.6nm、156.1nm,分散指數(shù)(PDI)平均值分別為0.302、0.246、0.284,制得的脂質(zhì)體粒徑均符合要求,且粒徑分布集中,體系均趨于穩(wěn)定。5用流式細胞儀和激光共聚焦分析經(jīng)三組制劑處理的細胞相比陰性對照組,普通載藥制劑NL處理的細胞胞內(nèi)平均熒光強度有很大的提高,表明DSPE-PEG修飾的PEG化脂質(zhì)體提高了細胞攝取效率。CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL處理的細胞胞內(nèi)平均熒光強度相比NL大幅提高,表明CPP修飾的載藥PEG化脂質(zhì)體能進一步增強細胞的攝取效率。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,三種制劑均成功地將si RNA輸送到細胞質(zhì)中,經(jīng)CPP修飾的脂質(zhì)體CL、CHL輸送si RNA至細胞質(zhì)中的數(shù)目(綠色熒光)相比普通脂質(zhì)體NL明顯增多,與流式分析結(jié)果相對應(yīng)。6用激光共聚焦顯微鏡分析經(jīng)CL、CHL制劑處理的A549細胞兩組制劑均成功將si RNA輸送到細胞質(zhì)中,且隨著制劑作用時間的延長,細胞質(zhì)中si RNA的數(shù)目越多,表明經(jīng)CPP修飾的脂質(zhì)體有效地促進了si RNA的胞內(nèi)逃逸。結(jié)論:實驗結(jié)果表明,DSPE-PEG-Hz-CPP的合成路線簡單,合成過程中未用高毒性試劑,方法重現(xiàn)性好。成功地制備了含腙鍵的CPP修飾的載藥脂質(zhì)體CHL,并與普通脂質(zhì)體NL和CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL進行細胞攝取效率的比較。三組制劑均使得細胞攝取效率提高,經(jīng)CPP修飾的載藥脂質(zhì)體CL和CHL的細胞攝取效率相對較高。
【關(guān)鍵詞】：細胞穿透肽 腙鍵 脂質(zhì)體 siRNA RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943
【目錄】：

• 摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫12-13
• 引言13-15
• 第一部分 功能性脂材DSPE-PEG-Hz-CPP的合成15-21
• 前言15
• 材料與方法15-17
• 結(jié)果17-18
• 附圖18-20
• 討論20
• 小結(jié)20
• 參考文獻20-21
• 第二部分 脂質(zhì)體的制備和表征21-29
• 前言21
• 材料與方法21-23
• 結(jié)果23-24
• 附圖24-26
• 附表26-27
• 討論27
• 小結(jié)27-28
• 參考文獻28-29
• 第三部分 脂質(zhì)體-細胞相互作用29-42
• 前言29
• 材料與方法29-34
• 結(jié)果34-35
• 附圖35-39
• 附表39-41
• 討論41
• 小結(jié)41
• 參考文獻41-42
• 結(jié)論42-43
• 綜述pH和離子敏感的聚合物在藥物釋放過程中的應(yīng)用43-56
• 參考文獻52-56
• 致謝56-57
• 個人簡歷57

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本文編號：383059