本文關(guān)鍵詞：溫度和pH雙敏感納米凝膠的制備及其抗乳腺癌協(xié)同機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種尿嘧啶類似物,通過(guò)抑制脫氧胸苷酸合成酶以及插入RNA和DNA而干擾核苷代謝,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性,引起細(xì)胞死亡,被廣泛應(yīng)用于乳腺癌的治療。然而,其強(qiáng)烈毒副作用的出現(xiàn),極大限制了5-FU的臨床療效。因此,亟待探索治療新策略。納米醫(yī)藥的興起有望解決傳統(tǒng)化療存在的問題。作為廣泛應(yīng)用的納米材料之一,納米凝膠是一種能夠被水溶脹的、具有三維鉸鏈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米級(jí)高分子聚集體,其多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),不但能顯著增強(qiáng)凝膠體系的體內(nèi)外穩(wěn)定性,且能負(fù)載大量親水性生物活性藥物,成為遞送親水性化療藥物5-FU的最佳載體。此外,通過(guò)引進(jìn)功能性單體獲得具有刺激響應(yīng)性的凝膠,即智能納米凝膠。其中,聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)已被大量用于構(gòu)建溫度響應(yīng)性納米載藥體系,其體積相轉(zhuǎn)變溫度(VPTT)約為32℃,基于PNIPAM的凝膠能夠隨著溫度的變化發(fā)生微觀結(jié)構(gòu)和性能的轉(zhuǎn)變。然而,對(duì)于該溫敏凝膠藥物遞送系統(tǒng)在細(xì)胞水平的機(jī)制研究很少。我們知道,陽(yáng)離子聚乙烯亞胺(PEI)因其可逆質(zhì)子化鏈,不僅能夠有效穿過(guò)雙層磷脂膜結(jié)構(gòu),還具有pH響應(yīng)性,適用于研究納米體系在細(xì)胞水平的機(jī)制。因此,本課題中,我們利用自由基接枝共聚合反應(yīng)并通過(guò)在線(in-situ)自組裝制備了具有溫敏PNIPAM內(nèi)核和pH敏感PEI外殼的雙敏感智能納米凝膠[Poly(N-isopropyl acrylamide-g-ethylene amine),PNIPAM-g-PEI]。動(dòng)靜態(tài)光散射儀、Zeta電位儀和透射電鏡的輔助數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)該納米凝膠具有規(guī)整的核殼結(jié)構(gòu)和可被精細(xì)調(diào)節(jié)的表面物化特性,隨著PEI鏈的增加,該納米凝膠的VPTT從32℃提高到了39℃。體內(nèi)外研究表明,該智能納米凝膠是負(fù)載水溶性藥物5-FU(5-FU-gel)的有效載體,因其溫敏被動(dòng)靶向功能而特異高效地富集在腫瘤部位,使胞內(nèi)藥物濃度增高,對(duì)乳腺癌的療效顯著、持久。我們以乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231為靶細(xì)胞,深入探索載藥納米凝膠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的方式及其胞內(nèi)水平相關(guān)機(jī)制。CCK-8檢測(cè)的增殖抑制結(jié)果表明,5-FU-gel能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖;且隨著孵育溫度從37℃(TVPTT)升高到40℃(TVPTT),細(xì)胞對(duì)納米凝膠體系的內(nèi)吞量明顯增加,證實(shí)基于PNIPAM的溫敏被動(dòng)靶向功能。研究表明,納米體系的胞內(nèi)路徑主要是內(nèi)涵體-自噬體-溶酶體,我們?cè)诩す夤簿劢箳呙栾@微鏡(CLSM)下通過(guò)熒光共定位和自噬相關(guān)蛋白LC-3的檢測(cè)來(lái)追蹤凝膠體系的胞內(nèi)路徑,并利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和氯喹(CQ)來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞器的形成。結(jié)果顯示,納米凝膠主要富集于溶酶體,聯(lián)合3-MA抑制自噬的起始步驟后主要富集于內(nèi)涵體,而聯(lián)合CQ抑制自噬下游步驟后主要富集于自噬體。另一方面,CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示5-FU-gel、5-FU-gel+CQ、5-FU-gel+3MA對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷能力依次降低,提示溶酶體是載藥納米凝膠發(fā)揮作用的主要細(xì)胞器。我們進(jìn)一步研究了可質(zhì)子化的PEI是否會(huì)引起溶酶體依賴的相關(guān)機(jī)制。通過(guò)檢測(cè)溶酶體結(jié)合膜蛋白LAMP-2及組織蛋白酶B,發(fā)現(xiàn)5-FU-gel的PEI鏈在溶酶體中酸性pH環(huán)境下發(fā)生質(zhì)子化,利用質(zhì)子海綿效應(yīng)使納米凝膠溶脹,大量釋放所負(fù)載的5-FU,抑制靶細(xì)胞核苷酸的生物合成,從而殺傷靶細(xì)胞;同時(shí),強(qiáng)質(zhì)子化后的PEI鏈能破壞溶酶體膜,使組織蛋白酶B彌散至胞質(zhì)中,引起下游信號(hào)通路的激活。經(jīng)FITC-Annexin V和PI雙染后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)意外地發(fā)現(xiàn),5-FU-gel能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡,且孵育溫度為40℃時(shí)的凋亡程度比37℃時(shí)更加明顯。通過(guò)CLSM觀察線粒體膜電位變化和細(xì)胞色素c釋放情況,并用western blot技術(shù)檢測(cè)caspase-9蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)5-FU-gel引起線粒體膜電位下降、細(xì)胞色素c釋放和caspase-9蛋白表達(dá)量增加,說(shuō)明5-FU-gel誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是線粒體介導(dǎo)的caspase依賴性的凋亡。綜上所述,溫度和pH雙敏感納米凝膠可通過(guò)溫敏內(nèi)核促進(jìn)其被腫瘤細(xì)胞攝取,具有被動(dòng)靶向功能;同時(shí),我們率先研究發(fā)現(xiàn),其質(zhì)子化的PEI外殼不但能大量釋放所負(fù)載的親水性化療藥物5-FU,且能通過(guò)破壞溶酶體和線粒體膜從而協(xié)同誘導(dǎo)caspase依賴性細(xì)胞凋亡。本課題展示了負(fù)載5-FU智能納米凝膠引起腫瘤細(xì)胞死亡的協(xié)同機(jī)制研究上的巨大進(jìn)步及其在臨床應(yīng)用中的潛在價(jià)值,期望能為更好地設(shè)計(jì)靶向細(xì)胞器的納米藥物提供理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：5-氟尿嘧啶 納米凝膠 溫敏 質(zhì)子化 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943;R96
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 縮略詞表10-12
• 前言12-14
• 第一部分 智能納米凝膠的制備及性能研究14-23
• 一、實(shí)驗(yàn)材料15
• 二、實(shí)驗(yàn)方法15-17
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-21
• 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論21-23
• 第二部分 智能納米凝膠的抗乳腺癌作用研究23-33
• 一、實(shí)驗(yàn)材料24
• 二、實(shí)驗(yàn)方法24-28
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-31
• 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論31-33
• 第三部分 智能納米凝膠的抗乳腺癌協(xié)同機(jī)制研究33-55
• 一、實(shí)驗(yàn)材料34-38
• 二、實(shí)驗(yàn)方法38-43
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-48
• 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論48-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 綜述 納米凝膠的特性和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用59-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說(shuō)明70-71
• 致謝71

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本文編號(hào)：378670