抗癌肽是一類小分子多肽類新型抗癌藥物,通過破壞腫瘤細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、抑制癌細(xì)胞增殖和遷移以及腫瘤血管的形成等達(dá)到對癌細(xì)胞殺傷作用,而對正常細(xì)胞的毒性較低,是目前抗腫瘤新藥研究的一大熱點。研究發(fā)現(xiàn)心房利鈉肽ANP(Atrial natriuretic peptide)來源的心房肽類激素可以強力抑制癌細(xì)胞DNA的合成,從而抑制癌細(xì)胞的生長,而對正常的人體細(xì)胞無損傷;它還可以緩解抗癌藥物對腎臟、肝臟的毒性作用。在癌組織細(xì)胞表達(dá)ANP既可以解決多肽類藥物半衰期短的問題,也可以避免對其他細(xì)胞的副作用。采用基因治療的策略,用重組腺病毒感染哺乳動物細(xì)胞分泌表達(dá)抗癌肽ANP,使ANP與癌細(xì)胞“親密接觸”,克服抗癌藥物不易到達(dá)靶點的缺點,同時可以在癌癥組織細(xì)胞持續(xù)表達(dá)抗癌肽ANP,達(dá)到高效殺滅癌細(xì)胞的目的。本研究根據(jù)ANP的cDNA序列設(shè)計特異性引物,通過提取細(xì)胞內(nèi)RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,PCR得到ANP基因。設(shè)計攜帶Igκ信號肽的重疊PCR引物,重疊PCR獲得Igκ信號肽基因,將ANP基因和Igκ信號肽基因通過重疊PCR獲得IgANP基因。將ANP與IgANP基因連接T載體經(jīng)測序鑒定正確后,分別將ANP...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 抗癌肽的概述
    1.2 ANP的簡介
        1.2.1 ANP的來源
        1.2.2 ANP的作用機理
    1.3 腺病毒的簡介
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 重組腺病毒載體的構(gòu)建和重組腺病毒的包裝
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗細(xì)胞、菌株
        2.1.2 質(zhì)粒
        2.1.3 實驗試劑及耗材
        2.1.4 實驗儀器設(shè)備
        2.1.5 培養(yǎng)基及各試劑配方
        2.1.6 相關(guān)緩沖液和其它試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 ANP和 Ig ANP基因的獲得
        2.2.2 ANP和 Ig ANP基因穿梭載體的構(gòu)建
        2.2.3 BJ5183 同源重組構(gòu)建重組腺病毒載體pAdEasy-ANP
        2.2.4 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞獲得重組腺病毒
        2.2.5 重組腺病毒的質(zhì)量控制
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 ANP基因的PCR擴增
        2.3.2 重疊PCR獲取IgANP基因
        2.3.3 克隆載體的提取
        2.3.4 克隆載體雙酶切鑒定
        2.3.5 克隆載體和腺病毒穿梭空載體雙酶切回收
        2.3.6 腺病毒穿梭載體的提取
        2.3.7 腺病毒穿梭載體載體雙酶切鑒定
        2.3.8 腺病毒穿梭載體的單酶切線性化及回收
        2.3.9 腺病毒表達(dá)載體的提取
        2.3.10 腺病毒表達(dá)載體單酶切鑒定
        2.3.11 腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)DH5α提質(zhì)粒
        2.3.12 腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)DH5α質(zhì)粒酶切鑒定
        2.3.13 重組腺病毒的的包裝
        2.3.14 重組腺病毒的PCR鑒定
        2.3.15 重組腺病毒的質(zhì)量控制
    2.4 小結(jié)
第三章 重組腺病毒表達(dá)抗癌肽ANP對舌癌細(xì)胞的作用效果
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗細(xì)胞
        3.1.2 主要實驗試劑
        3.1.3 培養(yǎng)基及各試劑配方
        3.1.4 主要實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 感染復(fù)數(shù)的確定
        3.2.2 RT-PCR檢測重組腺病毒在舌癌細(xì)胞中表達(dá)檢測
        3.2.3 免疫熒光實驗鑒定重組腺病毒在舌癌細(xì)胞中的表達(dá)
        3.2.4 MTT細(xì)胞相對活性檢測
        3.2.5細(xì)胞克隆形成實驗
        3.2.6 細(xì)胞劃痕實驗測定細(xì)胞遷移率
        3.2.7 流式細(xì)胞儀檢測周期
        3.2.8 流式細(xì)胞儀檢測凋亡
        3.2.9 Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)
        3.2.10 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 感染復(fù)數(shù)的確定
        3.3.2 RT-PCR檢測ANP的表達(dá)
        3.3.3 免疫熒光鑒定ANP的表達(dá)
        3.3.4 MTT檢測細(xì)胞相對活性
        3.3.5克隆形成實驗
        3.3.6 細(xì)胞劃痕實驗測定細(xì)胞遷移率
        3.3.7 流式細(xì)胞儀檢測周期
        3.3.8 流式檢測細(xì)胞凋亡
        3.3.9 Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況
    3.4 小結(jié)
第四章 結(jié)論與討論
    4.1 重組腺病毒載體的構(gòu)建和重組腺病毒的包裝
    4.2 重組腺病毒表達(dá)抗癌肽ANP對舌癌細(xì)胞的抑制效果
參考文獻
致謝
附錄



本文編號：3763169