本文關(guān)鍵詞：載鹽霉素的聚乙二醇—神經(jīng)酰胺膠束的抗肝癌作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本課題成功設(shè)計了載鹽霉素的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束(SCM),它將具有治療作用的鹽霉素(SAL)包載于載體聚乙二醇-神經(jīng)酰胺(PEG-CRM)形成的膠束內(nèi),以同時殺傷肝癌細胞和肝癌干細胞。由于可提高SAL的水溶性和載體對普通肝癌細胞的殺傷能力的增強作用,加之膠束的滲透性使得更多的SAL靶向到腫瘤部位,為肝癌的治療提供新的策略。首先,利用高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法建立鹽霉素的體內(nèi)外檢測方法學,并考察方法學的專屬性、線性、精密度和準確度等,為SAL的體內(nèi)外測定提供基礎(chǔ)。結(jié)果顯示,該方法測定SAL具有特異性,且在7.8~1000μg/mL的濃度范圍內(nèi),SAL的濃度(C)與峰面積(A)呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為A=1012.4C+7115.6(R2=0.9999)。本課題所建立的高效液相色譜法所測得的SAL的精密度和準確度變動范圍均在3%之內(nèi),表明該方法學可用于測定SAL的濃度,符合實驗的要求。以非諾貝特(FNBT)為內(nèi)標建立測定體內(nèi)SAL的LC-MS檢測方法,線性范圍為20~1000ng/m L時,線性回歸方程為A=0.005995C-0.01851,R2=0.999,定量下限為20ng/mL。當S/N≥3時,SAL的最低檢測限為4 ng/mL,可滿足實驗的要求。其次,主要考察鹽霉素和聚乙二醇-神經(jīng)酰胺對腫瘤細胞和腫瘤干細胞的殺傷毒性。我們選取的是肝癌HepG2細胞系以及通過懸浮狀態(tài)培養(yǎng)形成的HepG2微球體。大量培養(yǎng)HepG2細胞并考察SAL和PEG-ceramide兩種藥物在HepG2細胞系的相互作用,即將兩種游離藥物分別以1:2,1:3,1:4三種摩爾比例混合,對HepG2肝癌細胞進行殺傷,篩選得到游離SAL和PEG-ceramide兩者聯(lián)用比例為1:4或1:2(mol/mol)時,對HepG2細胞殺傷效果較好。隨后制備兩種藥載比的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束,對HepG2細胞及其微球體進行殺傷,發(fā)現(xiàn)兩種藥載比膠束的殺傷效果無顯著性差異,但是考慮到鹽霉素的毒性,最終確定1:4為SAL和PEG-ceramide兩藥聯(lián)合作用的最佳協(xié)同比例。第三,利用薄膜分散法制備上述優(yōu)化比例的載鹽霉素的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束,并對其理化性質(zhì),包括粒徑、Zeta電位、臨界膠束濃度(CMC)、包封率、載藥量及體外釋放度進行考察,發(fā)現(xiàn)所制備的載藥膠束粒徑為11.02±2.34nm,Zeta電位為-5.66±0.77mV,臨界膠束濃度值為7.94μg/mL,包封率和載藥量分別為76.74±4.05%和6.32±0.57%,在中性條件下48h累計釋放率為65%,表現(xiàn)出一定的緩釋特性。用透射電鏡觀察其形態(tài),發(fā)現(xiàn)其大小均一,分散均勻且無粘連。第四,我們將上述制備的優(yōu)化比例的載藥膠束(SCM)進行了體外細胞學考察,包括采用CCK-8(Cell Counting Kit-8,細胞計數(shù)試劑盒)法測定膠束對HepG2細胞及其微球體的毒性,Annexin V-FITC/PI雙染法考察肝癌Hep G2細胞和微球體的凋亡,克隆形成實驗、微球體形成率實驗測定HepG2細胞及其微球體給藥后各組肝癌細胞的增殖能力以及利用激光共聚焦儀器考察肝癌HepG2細胞、HepG2-TS及HepG2-TS單細胞懸液對載熒光物質(zhì)的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束的攝取能力。結(jié)果表明,將SAL以1:4的藥載比包裹于PEG-ceramide膠束中較游離SAL對HepG2細胞以及微球體的細胞殺傷作用更強,誘導細胞凋亡及抑制細胞增殖的能力更強,而且,由實驗結(jié)果可知,HepG2細胞及HepG2-TS對載熒光物質(zhì)PECF的PEG-ceramide膠束的攝取能力更強,進一步表明聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束具有較強的靶向肝癌細胞和肝癌干細胞的能力。最后,我們對新制備的載藥膠束進行了體內(nèi)動物實驗的考察。首先考察膠束載體對BALB/C小鼠的安全性,即小鼠尾靜脈給藥后,對小鼠心、肝、脾、肺、腎做CD68免疫組化和HE染色,并對小鼠血液進行血常規(guī)分析,結(jié)果表明膠束載體僅對小鼠肝和腎產(chǎn)生輕微的毒性,且具有一過性,具備用藥安全特性。其次,制備包載熒光探針Dir的PEG-ceramide膠束,通過建立HepG2荷瘤裸鼠模型,評價熒光膠束在動物體內(nèi)的分布和腫瘤靶向性,結(jié)果表明載Dir熒光物質(zhì)的膠束主要分布在肝和腫瘤中,且在腫瘤部位有更多的蓄積,具有很強的腫瘤靶向和腫瘤滲透性。隨后制備腫瘤冰凍切片以期探討載PECF熒光染料膠束的靶向性,結(jié)果顯示載PECF的熒光膠束在腫瘤部位的熒光強度最大,靶向性最好。接著利用LC-MS分析載藥膠束在SD大鼠體內(nèi)有關(guān)鹽霉素的藥動學特征,結(jié)果顯示載藥聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束(SCM)和載藥DSPE-PEG膠束(SDM)均可延緩SAL在血漿中的消除,而且SCM效果更顯著。最后從離體腫瘤的大小、離體腫瘤的重量、腫瘤體積生長曲線以及裸鼠體重變化四個方面考察各組藥物處方的體內(nèi)抗腫瘤活性與系統(tǒng)毒性,結(jié)果顯示SCM膠束組無明顯的系統(tǒng)毒性,且抗腫瘤活性效果更佳。綜上所述,本課題所制備的載鹽霉素的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束能夠有效的殺傷肝癌細胞和肝癌干細胞,具有較好的體內(nèi)的抗腫瘤活性,在肝癌治療方面表現(xiàn)出良好的應用前景。
【關(guān)鍵詞】：聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束 鹽霉素 肝癌細胞 肝癌干細胞
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943;R96
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-16
• 第一章 SAL體外含量測定方法的建立16-21
• 一、儀器與試劑16-17
• （一）儀器16
• （二）材料與試劑16-17
• 二、實驗方法與結(jié)果17-20
• （一）SAL含量測定方法的建立17-18
• （二）SAL含量測定方法的結(jié)果18-20
• 三、小結(jié)20-21
• 第二章 SAL和PEG-ceramide的細胞毒性實驗21-29
• 一、儀器與試劑21-22
• （一）儀器21
• （二）試劑21-22
• （三）細胞22
• 二、實驗方法與結(jié)果22-28
• （一）肝癌Hep G2細胞及HepG2微球體的培養(yǎng)22-24
• （二）細胞毒性及結(jié)果24-26
• （三）協(xié)同比例的確定及結(jié)果26-28
• 三、小結(jié)28-29
• 第三章 納米膠束的制備及表征29-35
• 一、儀器與試劑29-30
• （一）儀器29
• （二）試劑29-30
• 二、實驗方法與結(jié)果30-34
• （一）納米膠束的制備30
• （二）納米膠束的處方優(yōu)化30-31
• （三）納米膠束的表征31-34
• 三、小結(jié)34-35
• 第四章 體外抗肝癌細胞和肝癌干細胞的活性研究35-47
• 一、儀器與材料35-36
• （一）儀器35
• （二）材料35-36
• （三）細胞36
• 二、實驗方法與結(jié)果36-46
• （一）細胞毒性實驗36-39
• （二）細胞凋亡實驗39-42
• （三）克隆形成實驗42-44
• （四）微球體形成率實驗44
• （五）細胞攝取實驗44-46
• 三、小結(jié)46-47
• 第五章 納米膠束的體內(nèi)抗肝癌活性研究47-63
• 一、儀器與試劑47-48
• （一）儀器47
• （二）材料47-48
• （三）動物48
• 二、實驗方法與結(jié)果48-61
• （一）膠束體內(nèi)安全性評價48-51
• （二）膠束體內(nèi)靶向性評價51-54
• （四）膠束體內(nèi)藥代動力學54-58
• （五）膠束體內(nèi)藥效學研究58-61
• 三、小結(jié)61-63
• 全文總結(jié)63-65
• 參考文獻65-71
• 腫瘤治療新策略：聯(lián)合藥物療法同時殺傷腫瘤細胞和腫瘤干細胞（綜述）71-83
• 參考文獻77-83
• 碩士期間發(fā)表論文及參加科研工作情況83-84
• 致謝84

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