為實(shí)現(xiàn)降糖多肽Brevinin-2GUb在大腸桿菌中的高效表達(dá),本文將Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧還蛋白、His標(biāo)簽及腸激酶酶切位點(diǎn)的p ET32a載體中,將重組表達(dá)載體p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白。通過(guò)對(duì)表達(dá)溫度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示16℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h后融合蛋白產(chǎn)量達(dá)到36 mg/L;該融合蛋白經(jīng)腸激酶(EK)特異性切割后成功獲得不帶標(biāo)簽的Brevinin-2GUb多肽,產(chǎn)量約為2.50 mg/L,純度達(dá)90%以上。通過(guò)反相高效液相色譜對(duì)重組表達(dá)的Brevinin-2GUb進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示重組表達(dá)的Brevinin-2GUb與人工合成的Brevinin-2GUb的氨基酸序列一致。通過(guò)血平板檢測(cè)發(fā)現(xiàn),170μg/m L的重組表達(dá)Brevinin-2GUb多肽無(wú)溶血效應(yīng)。此外,重組表達(dá)的Brevinin-2GUb多肽在濃度為10μg/m L時(shí)對(duì)INS-1細(xì)胞產(chǎn)生顯著的刺激胰島素分泌作用(為基礎(chǔ)釋放量的120.04%;p<0.01)。研究結(jié)果為Brev...

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株與質(zhì)粒
        1.1.2 試劑
        1.1.3 多肽
    1.2 方法
        1.2.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb
            1.2.1. 1 Brevinin-2GUb基因的擴(kuò)增
            1.2.1. 2 RF線性擴(kuò)增反應(yīng)構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb
        1.2.2 融合蛋白Trx-His-EK-Brevinin-2GUb在大腸桿菌BL21(DE3）中的小量表達(dá)及表達(dá)溫度優(yōu)化
        1.2.3 融合蛋白Trx-His-EK-Brevinin-2GUb在大腸桿菌BL21(DE3）中的大量表達(dá)及純化
        1.2.4 融合蛋白的腸激酶酶切及純化
        1.2.5 反相高效液相色譜鑒定重組表達(dá)的Brevinin-2GUb
        1.2.6 圓二色光譜測(cè)定Brevinin-2GUb的二級(jí)結(jié)構(gòu)
        1.2.7 質(zhì)譜檢測(cè)重組表達(dá)的Brevinin-2GUb是否形成二硫鍵
        1.2.8 Brevinin-2GUb的溶血活性測(cè)定
        1.2.9 Brevinin-2GUb對(duì)INS-1細(xì)胞的促進(jìn)胰島素分泌活性鑒定
        1.2.1 0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb重組質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.2 融合蛋白的重組表達(dá)及純化
    2.3 融合蛋白的腸激酶酶切及純化
    2.4 反相高效液相色譜鑒定重組表達(dá)的Brevinin-2GUb
    2.5 圓二色光譜測(cè)定Brevinin-2GUb的二級(jí)結(jié)構(gòu)
    2.6 質(zhì)譜檢測(cè)重組表達(dá)Brevinin-2GUb是否形成二硫鍵
    2.7 Brevinin-2GUb的溶血活性分析
    2.8 Brevinin-2GUb的促胰島素分泌活性鑒定
3 結(jié)論



本文編號(hào)：3745547