氨肽酶N（Aminopeptidase N, APN）是屬于鋅離子依賴性金屬蛋白酶的一類膜結(jié)合型外肽酶,以同源二聚體結(jié)構(gòu)存在于細(xì)胞膜。APN廣泛存在于大腦、腎、肝臟、胎盤和子宮等。與正常細(xì)胞相比,APN在癌細(xì)胞表面高水平表達(dá),對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤新血管的形成起著重要的作用,被稱為腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)抗原CD13。近年來,以APN為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略迅速發(fā)展起來,APN抑制劑已經(jīng)成為抗癌藥物研究的熱點(diǎn)課題。因此,發(fā)展和建立快速、可靠及高通量APN抑制劑篩選方法對(duì)于研發(fā)新藥物具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis, CE）具有樣品消耗量少、分離效率高、分析時(shí)間短及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于酶反應(yīng)的測(cè)定中,成為了酶活性及酶抑制劑篩選研究常使用的分析手段。電泳調(diào)控微分析法（Electrophoretically Mediated Microanalysis, EMMA）是以毛細(xì)管電泳柱進(jìn)樣端約1.5～2.0 cm部分作為反應(yīng)的微室,將酶溶液和底物溶液依次進(jìn)樣到毛細(xì)管中,接著施加一段時(shí)間小電壓讓酶和底物溶液在毛細(xì)管中充分混合并反應(yīng),當(dāng)酶促... 

【文章頁(yè)數(shù)】：86 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號(hào)說明
前言
    1 氨肽酶N與腫瘤的關(guān)系
        1.1 降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)侵襲轉(zhuǎn)移
        1.2 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞新血管生成
    2 氨肽酶N抑制劑
        2.1 APN的天然抑制劑
        2.2 APN的小分子合成類抑制劑
    3 氨肽酶N及其抑制劑的活性測(cè)定方法
    4 毛細(xì)管電泳法在酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用
        4.1 毛細(xì)管電泳在酶反應(yīng)測(cè)定中的應(yīng)用模式
        4.2 電泳調(diào)控微分析法在酶反應(yīng)測(cè)定中的應(yīng)用
    5 毛細(xì)管電泳法在藥物與細(xì)胞膜作用研究中的應(yīng)用
        5.1 細(xì)胞膜與藥物的相互作用
        5.2 細(xì)胞膜毛細(xì)管電泳法
    6 本課題研究目的及主要內(nèi)容
第一章 氨肽酶N抑制劑電泳調(diào)控微分析篩選方法的研究和應(yīng)用
    1 儀器與材料
        1.1 儀器
        1.2 材料
        1.3 電泳條件
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 溶液的配制
        2.2 毛細(xì)管柱的維護(hù)
        2.3 EMMA步驟
        2.4 氨肽酶N活性研究
        2.5 氨肽酶N抑制劑抑制動(dòng)力學(xué)研究及抑制劑的篩選
        2.6 酶標(biāo)法
    3 結(jié)果與討論
        3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
        3.2 分離條件的優(yōu)化與選擇
            3.2.1 電泳分離模式的選擇
            3.2.2 分離緩沖液中脫氧膽酸鈉濃度的考察
            3.2.3 分離緩沖溶液HEPES濃度的考察
            3.2.4 分離緩沖溶液pH影響
            3.2.5 電泳溫度的考察
            3.2.6 分離電壓的考察
        3.3 EMMA條件的優(yōu)化
            3.3.1 混合條件的選擇
            3.3.2 酶促反應(yīng)時(shí)間的考察
            3.3.3 底物濃度的考察
        3.4 方法驗(yàn)證
        3.5 氨肽酶N的K_m和V_(max)的測(cè)定
            3.5.1 酶標(biāo)法測(cè)定氨肽酶N的K_m和V_(max)
            3.5.2 EMMA法測(cè)定氨肽酶N的K_m和V_(max)
        3.6 陽性抑制劑APN抑制動(dòng)力學(xué)分析
        3.7 抑制劑篩選
            3.7.1 初篩
            3.7.2 復(fù)篩
            3.7.3 篩選結(jié)果分析
    4 小結(jié)
第二章 氨肽酶N細(xì)胞膜毛細(xì)管電泳法的建立與藥物篩選
    1 儀器與材料
        1.1 儀器
        1.2 材料
        1.3 電泳條件
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 溶液的配制
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3 細(xì)胞膜的制備
            2.3.1 細(xì)胞膜的分離提取
            2.3.2 細(xì)胞膜破碎方法的考察
            2.3.3 細(xì)胞膜表征
        2.4 細(xì)胞膜CE法
        2.5 模型的驗(yàn)證
        2.6 細(xì)胞膜APN動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定
        2.7 精密度考察
        2.8 抑制劑的篩選
    3 結(jié)果與討論
        3.1 細(xì)胞膜制備
            3.1.1 細(xì)胞膜分離提取
            3.1.2 細(xì)胞膜的表征
        3.2 篩選模型的驗(yàn)證
        3.3 測(cè)定細(xì)胞膜表面氨肽酶N的K_m
        3.4 精密度考察
        3.5 抑制劑篩選
            3.5.1 初篩
            3.5.2 復(fù)篩
    4 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表


【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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[3]雞APN組織定量、表達(dá)及其作為IBV受體可能性評(píng)價(jià)[D]. 明曉波.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
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本文編號(hào)：3733778