本文關(guān)鍵詞：左旋肉堿對NIH3T3成纖維細胞成骨分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：異位鈣化又稱異位骨化,是指鈣/磷復(fù)合物沉積于非鈣化的組織,繼而發(fā)生新骨形成的病理性現(xiàn)象。彈性纖維假黃瘤(pseudoxanthoma elasticum,PXE)是一種多系統(tǒng)的異位鈣化紊亂性疾病,其典型的特征為鈣磷復(fù)合物沉積于不同的組織內(nèi)。PXE由ABCC6基因突變引起,該基因編碼一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白ABCC6,該蛋白控制著通過細胞膜的轉(zhuǎn)運。ABCC6基因剔除小鼠是PXE的小鼠模型,涵蓋了PXE所有的癥狀。盡管調(diào)節(jié)異位鈣化的分子機制尚不清楚,但是許多證據(jù)都支持這種觀點:異位鈣化是一個細胞調(diào)節(jié)的過程。成纖維細胞(fibroblast,Fb)是參與異位骨化的的細胞,存在于全身結(jié)締組織中。研究證實,在適當?shù)拇碳l件下,成纖維細胞可以轉(zhuǎn)化為成骨細胞,最終形成礦化結(jié)節(jié)。左旋肉堿(L-Carnitine,LC)是轉(zhuǎn)運長鏈脂肪酸進入線粒體內(nèi)進行β-氧化的重要的輔助因子。研究表明,LC可以影響成骨細胞的活性。我們對于LC對成骨分化和礦化影響的認識始于實驗室前期的研究,實驗室前期通過代謝組學的方法對ABCC6基因剔除小鼠進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠血漿中LC的濃度下降,小鼠出現(xiàn)了全身廣泛的鈣化。因此,我們推測,LC是一種潛在的鈣化或礦化抑制因子。此外,通過動物和人類的研究發(fā)現(xiàn),補充LC可以增加血漿中胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors,IGF-1)的濃度,IGF-1可以促進骨基質(zhì)的合成和礦化。IGF-1在激活I(lǐng)GF-1/PI3K/Akt信號通路中發(fā)揮重要的作用,IGF-1/PI3K/Akt通路的激活可以有效的促進成骨細胞分化和鈣化。目的:本研究旨在探究LC對NIH3T3成纖維細胞的增殖、成骨分化以及礦化的影響,并對其可能的信號通路作進一步的探索,為異位骨化的進一步研究和治療提供一種新的思路。方法:(1)本研究擬采用小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3細胞建立一個異位礦化的細胞模型。nih3t3細胞在單磷誘導(dǎo)液(含有2mmna3po4的生長培養(yǎng)液)中培養(yǎng)12天,然后采用茜素紅染色和鈣離子檢測的方法對礦化結(jié)果進行檢測。(2)為了檢測lc對單磷誘導(dǎo)的nih3t3細胞增殖以及成骨分化的影響,nih3t3細胞在含有10μm和100μmlc的單磷誘導(dǎo)液中培養(yǎng)。擬采用mtt的方法來檢測lc對nih3t3成纖維細胞增殖的影響。(3)對成骨分化的影響,擬采用熒光定量pcr的方法檢測成骨標志性基因(runx2,alp和ocn)的表達。對于成骨活性的檢測,擬采用堿性磷酸酶(alp)試劑盒來檢測alp的活性,westernblot的方法來檢測runx2蛋白的表達。此外,擬采用茜素紅染色法來觀察礦化結(jié)節(jié)的形成,采用鈣離子試劑盒檢測鈣離子濃度的方法來檢測基質(zhì)礦化的情況。(4)對igf-1/pi3k/akt信號通路的影響,擬采用熒光定量pcr的方法檢測igf-1基因的表達,westernblot的方法檢測igf-1/pi3k/akt信號通路中p-akt蛋白的表達。結(jié)果:(1)茜素紅染色結(jié)果顯示,經(jīng)2mmna3po4誘導(dǎo)的nih3t3細胞(單磷誘導(dǎo)組)產(chǎn)生了礦化結(jié)節(jié),而正常對照組卻沒有出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)。茜素紅染色定量以及鈣離子檢測結(jié)果顯示單磷誘導(dǎo)組的鈣離子含量顯著高于正常對照組。(2)mtt檢測結(jié)果顯示10μmlc輕微促進了單磷誘導(dǎo)的nih3t3細胞的增殖,而100μmlc則輕微抑制了細胞的增殖。(3)熒光定量pcr的結(jié)果表明,與對照組相比,成骨標志性基因runx2,alp和ocn,在10μmlc的干預(yù)下均出現(xiàn)了輕微的上調(diào),而100μmlc組則出現(xiàn)了下調(diào)。成骨活性的檢測結(jié)果也表明alp活性和runx2蛋白的表達在10μmlc的干預(yù)下出現(xiàn)了提高,而100μmlc組則出現(xiàn)了下降。此外,茜素紅染色和鈣離子沉積的結(jié)果也表明10μmlc輕微促進了礦化,而100μmlc抑制了礦化。(4)igf-1/pi3k/akt信號通路的檢測結(jié)果表明,與對照組相比,10μmlc輕微促進了igf-1基因的表達,而p-akt蛋白的表達卻沒有明顯的變化,但是100μmlc組不但下調(diào)了igf-1基因的表達,而且p-akt蛋白的表達也出現(xiàn)了明顯的下降。結(jié)論:na3po4促進了nih3t3成纖維細胞的成骨分化和礦化,我們成功構(gòu)建了異位礦化的細胞模型。研究表明低濃度的lc可以輕微促進nih3t3成纖維細胞的增殖、成骨分化和礦化,而高濃度的lc對nih3t3成纖維細胞的增殖、成骨分化和礦化有輕微的抑制。高濃度lc對成骨分化和礦化的抑制與實驗室前期對abcc6基因剔除小鼠的代謝組學分析結(jié)果相吻合,表明lc是一種潛在的鈣化或礦化抑制因子。此外,高濃度的lc抑制了igf-1基因的表達和akt蛋白的磷酸化,也進一步提示lc是通過IGF-1/PI3K/Akt信號通路發(fā)揮其抑制作用的。
【關(guān)鍵詞】：異位骨化 成纖維細胞 左旋肉堿 IGF-1/PI3K/Akt 增殖 成骨分化
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 英文縮寫一覽表14-15
• 前言15-19
• 1 異位鈣化15-16
• 1.1 概述15
• 1.2 彈性纖維假黃瘤15-16
• 1.3 成纖維細胞16
• 2 左旋肉堿16-17
• 3 胰島素樣生長因子-117
• 4 IGF-1/PI3K/Akt信號通路17-18
• 5 實驗室前期研究18-19
• 第一章 異位礦化細胞模型的建立19-27
• 1 材料與方法19-25
• 1.1 實驗材料19-21
• 1.2 實驗方法21-25
• 2 實驗結(jié)果25
• 3 討論25-27
• 第二章 左旋肉堿對NIH3T3成纖維細胞增殖的影響27-31
• 1 材料與方法27-29
• 1.1 實驗材料27-28
• 1.2 實驗方法28-29
• 2 實驗結(jié)果29-30
• 3 討論30-31
• 第三章 左旋肉堿對NIH3T3成纖維細胞成骨分化和礦化的影響31-45
• 1 材料與方法31-42
• 1.1 實驗材料31-33
• 1.2 實驗方法33-42
• 2 實驗結(jié)果42-43
• 3 討論43-45
• 第四章 左旋肉堿對IGF-1/PI3K/Akt信號通路的影響45-55
• 1 材料與方法45-53
• 1.1 實驗材料45-47
• 1.2 實驗方法47-53
• 2 實驗結(jié)果53
• 3 討論53-55
• 參考文獻55-59
• 附錄59-61
• 綜述61-72
• Reference68-72
• 在校期間發(fā)表論文72-73
• 致謝73

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