背景:β-內(nèi)酰胺類抗生素的長期廣泛使用導致了大量耐藥菌株的產(chǎn)生,而這些耐藥菌的主要耐藥機制是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,使β-內(nèi)酰胺類抗生素降解失活。克拉維酸作為一種廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑已廣泛應用于臨床治療β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥菌的感染�？死S酸的主要生產(chǎn)菌株為棒狀鏈霉菌。目前關于棒狀鏈霉菌中初級代謝和次級代謝與克拉維酸合成之間的調(diào)控機制尚未十分明朗。目的:（1）發(fā)現(xiàn)棒狀鏈霉菌中調(diào)控克拉維酸合成的調(diào)控基因;（2）闡明新發(fā)現(xiàn)調(diào)控基因的調(diào)控功能和調(diào)控途徑。方法:采用同源重組雙交換法構(gòu)建調(diào)控基因的敲除突變株。同時采用固體發(fā)酵的生物活性檢測法和液體發(fā)酵的HPLC法檢測突變菌株的克拉維酸產(chǎn)量變化情況,從而發(fā)現(xiàn)調(diào)控CA合成的調(diào)控基因。隨后,采用液體發(fā)酵分析、轉(zhuǎn)錄組比較分析和RT-qPCR分析調(diào)控基因的調(diào)控功能,采用ChIP-seq和EMSA等技術分析調(diào)控基因的靶基因。結(jié)果:（1）雙組份信號傳導系統(tǒng)基因orf1717/1718敲除可顯著影響克拉維酸的生物合成,且在不同發(fā)酵條件下影響結(jié)果不同。（2）轉(zhuǎn)錄組及RT-qPCR分析顯示△1717/1718菌株的脂肪酸降解、精氨酸合成及氧化磷酸化的多種初級代謝途徑和克... 

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
主要符號表
摘要
Abstract
第一部分 前言
    1.1 克拉維酸介紹
    1.2 克拉維酸生物合成相關的基因簇
        1.2.1 克拉維酸基因簇
        1.2.2 克拉維烷基因簇
        1.2.3 旁系同源基因簇
    1.3 克拉維酸的生物合成途徑
    1.4 克拉維酸生物合成的調(diào)控
        1.4.1 途徑特異性調(diào)控基因
        1.4.2 γ-丁內(nèi)酯信號途徑
        1.4.3 σ因子調(diào)控系統(tǒng)
        1.4.4 其他調(diào)控機制
    1.5 雙組份信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)
    1.6 本研究擬解決的問題
第二部分 影響CA合成的調(diào)控基因
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 菌株
        2.1.2 質(zhì)粒
        2.1.3 引物
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 主要試劑及配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 鏈霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)
        2.2.2 鏈霉菌孢子收集及保存
        2.2.3 鏈霉菌總DNA提取的菌絲體培養(yǎng)與收集
        2.2.4 鏈霉菌總DNA提取
        2.2.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.6 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.7 DNA的瓊脂糖凝膠回收
        2.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細胞制備
        2.2.9 大腸桿菌熱擊轉(zhuǎn)化
        2.2.10 基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.11 大腸桿菌與鏈霉菌間接合轉(zhuǎn)移
        2.2.12 鏈霉菌基因敲除突變菌株PCR篩選驗證
        2.2.13 CA產(chǎn)量的生物活性檢測
        2.2.14 鏈霉菌CA液體發(fā)酵培養(yǎng)
        2.2.15 CA的HPLC檢測
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 鏈霉菌總DNA提取
        2.3.2 基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.3 基因敲除菌株構(gòu)建
        2.3.4 基因敲除菌株的CA固體發(fā)酵及檢測
        2.3.5 基因敲除菌株的CA液體發(fā)酵及檢測
    2.4 討論
第三部分 orf1717/1718對CA生物合成調(diào)控的分析
    3.1 材料與試劑
        3.1.1 菌株
        3.1.2 質(zhì)粒
        3.1.3 引物
        3.1.4 培養(yǎng)基
        3.1.5 主要試劑及配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 鏈霉菌CA液體發(fā)酵培養(yǎng)與收集
        3.2.2 pHLY-1717超表達質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.3 CA的HPLC檢測
        3.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序及分析
        3.2.5 鏈霉菌總RNA提取
        3.2.6 RT-qPCR
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 orf1717超表達菌株構(gòu)建
        3.3.2 △1717/1718和orf1717超表達菌株的液體發(fā)酵分析
        3.3.3 液體發(fā)酵條件下的轉(zhuǎn)錄組分析
        3.3.4 CA合成相關基因的RT-qPCR分析
    3.4 討論
第四部分 orf1717調(diào)控的靶基因分析
    4.1 材料與試劑
        4.1.1 菌株
        4.1.2 質(zhì)粒
        4.1.3 引物
        4.1.4 培養(yǎng)基
        4.1.5 主要試劑及配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 鏈霉菌ChIP-seq用菌絲體培養(yǎng)與收集
        4.2.2 1717 His重組蛋白的表達質(zhì)粒構(gòu)建
        4.2.3 重組蛋白1717His的表達純化及抗體制備
        4.2.4 pSET-1717Flag融合質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.5 Westernblot(蛋白質(zhì)免疫印跡)實驗
        4.2.6 ChIP-seq(染色質(zhì)免疫共沉淀)實驗
        4.2.7 EMSA(凝膠遷移/凝膠阻滯電泳)實驗
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 重組蛋白1717His的表達純化
        4.3.2 棒狀鏈霉菌1717Flag融合菌株的構(gòu)建
        4.3.3 棒狀鏈霉菌中ORF1717蛋白在發(fā)酵過程中的表達情況分析
        4.3.4 棒狀鏈霉菌1717Flag融合菌株的ChIP-seq
        4.3.5 1717 His蛋白與啟動子的EMSA分析
    4.4 討論
第五部分 結(jié)論與展望
參考文獻
致謝
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]轉(zhuǎn)錄組分析棒狀鏈霉菌F613-1高產(chǎn)克拉維酸的分子基礎[J]. 覃榮活,付加芳,宗工理,王志宇,曹廣祥.  生物技術通報. 2017(09)
[2]克拉維酸叔丁胺丙酮溶劑化物的研究[J]. 張曉曉,靳孝慶,唐云峰,曹廣祥.  廣東化工. 2015(15)
[3]棒狀鏈霉菌控制抗生素合成的調(diào)節(jié)機制[J]. 朱碧銀,洪文榮.  國外醫(yī)藥(抗生素分冊). 2010(06)
[4]β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸研究進展[J]. 孟勇,張國華,王忠彥,官家發(fā).  中國抗生素雜志. 2003(01)



本文編號：3697177