本文通過改變培養(yǎng)條件、過表達轉錄調節(jié)因子和異源表達的策略,從嗜熱毀絲菌Myctlioehthora thermophila和蛹蟲草Cordyceps milltaris中發(fā)現(xiàn)和分離出了常規(guī)實驗培養(yǎng)條件下沒有的次級代謝產(chǎn)物,并對化合物性質進行了初步抑菌實驗和抗腫瘤活性測試。主要的實驗結果如下:1、通過改變M thermophila的培養(yǎng)溫度,在37℃ PDA培養(yǎng)條件下,分離出了文獻中未報道的化合物。在5 L發(fā)酵罐中（2個）進行液體發(fā)酵共7 L,最后純化出該化合物。高分辨質譜知道該化合物的分子式為C26H39NO4,分子量為429。核磁檢測得出該化合物為MyCyeliothermophin A的衍生物,其在8-C上多了一個-OH,與MyceliothermophinA一樣,其對各種腫瘤細胞也有毒性作用。其中對DLD-1的IC50為 1.47 μg/mL,對Hep3B的IC50為1.66 μg/mL,對HepG2的IC50為 1.73μg/mL,對HGC的IC50為0.32 μg/mL。2、利用過表達轉錄調節(jié)因子（TF）的策略,成功激活M thermophila原先沉默的NR-PKS基因簇。... 

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
中文文摘
緒論
    1 嗜熱毀絲菌Myceliphthora thermophila和蛹蟲草Cordyceps mliltaris簡介
        1.1 嗜熱毀絲菌M.thermophila
        1.2 蛹蟲草C.militaris
    2 天然產(chǎn)物概述
        2.1 天然產(chǎn)物
        2.2 主要天然產(chǎn)物分類
    3 次級代謝基因簇
    4 沉默的基因簇
    5 天然產(chǎn)物基因組挖掘
        5.1 什么是基因組挖掘
        5.2 真菌中天然產(chǎn)物基因組挖掘
        5.3 天然產(chǎn)物基因組挖掘的常用策略
    6 課題研究的目的、主要內容及創(chuàng)新點
        6.1 本課題的研究目的
        6.2 本課題的主要研究內容
        6.3 本課題的創(chuàng)新點
第一章 嗜熱毀絲菌 Myceliophthora thermophila的發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物的分離純化
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 菌株
        2.2 培養(yǎng)基
        2.3 試劑
        2.4 實驗儀器
    3 實驗方法
        3.1 液體發(fā)酵嗜熱真菌M.thermophila
        3.2 對發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化
            3.2.1 發(fā)酵液的萃取
            3.2.2 發(fā)酵液的初分離
            3.2.3 利用液相色譜儀分離得到純品
        3.3 核磁檢測樣品的處理
        3.4 化合物的抗腫瘤活性測試
    4 結果與分析
        4.1 液體發(fā)酵嗜熱真菌M.hermophila
        4.2 利用液相色譜儀分離得到純品
        4.3 化合物1的抗腫瘤活性測試
    5 小結與討論
第二章 過表達轉錄調節(jié)因子激活M.thermophila的沉默基因簇及其產(chǎn)物分離鑒定
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 菌株
        2.2 培養(yǎng)基
        2.3 試劑
        2.4 實驗儀器
    3 實驗方法
        3.1 M. thermophila基因組的提取
        3.2 M. thermophila原生質體的制備
        3.3 基因的擴增
        3.4 DNA的瓊脂糖電泳
        3.5 PCR產(chǎn)物的膠回收
        3.6 載體的雙酶切
        3.7 目的片段與載體的連接(T4 Polymerase DNA assembly)
        3.8 大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細胞的制備
        3.9 大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉化
        3.10 大腸桿菌質粒的提取
        3.11 重組克隆載體的驗證
        3.12 M.thermophila原生質體的轉化
        3.13 表達產(chǎn)物的質譜(LC-MS)檢測
        3.14 產(chǎn)物的大規(guī)模固體發(fā)酵與萃取
        3.15 產(chǎn)物的純化與結構鑒定
        3.16 產(chǎn)物的抑菌實驗測試
    4 結果與分析
        4.1 提取的M.hermophila基因組電泳圖
        4.2 目的片段(TF)的PCR電泳圖
        4.3 載體的構建
        4.4 M. thermophila的原生質體
        4.5 發(fā)酵產(chǎn)物HPLC-MS檢測
        4.6 利用液相色譜儀分離得到純品
        4.7 產(chǎn)物的抑菌實驗測試
    5 小結與討論
第三章 異源表達蛹蟲草C.militaris的PKS-NRPS基因簇及其產(chǎn)物分離鑒定
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 菌株和質粒
        2.2 培養(yǎng)基
        2.3 試劑
        2.4 實驗儀器
        2.5 本實驗所用到的per引物
    3 實驗方法
        3.1 C.militaris基因組的提取
        3.2 A.nidulans原生質體的制備
        3.3 基因的擴增
        3.4 DNA的瓊脂糖電泳和PCR產(chǎn)物的膠回收
        3.5 載體的雙酶切
        3.6 釀酒酵母BJ5464感受態(tài)的制備
        3.7 酵母感受態(tài)細胞的轉化(質粒的assembly構建)
        3.8 酵母質粒的提取
        3.9 大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉化及質粒的提取
        3.10 重組克隆載體的驗證
        3.11 A.nidulans原生質體的轉化
        3.12 表達產(chǎn)物的質譜(LC-MS)檢測
        3.13 產(chǎn)物的大規(guī)模固體發(fā)酵與萃取
        3.14 產(chǎn)物的純化與結構鑒定
        3.15 產(chǎn)物的抑菌實驗測試
        3.16 產(chǎn)物的抗腫瘤測試
    4 結果與分析
        4.1 提取的C.militaris基因組電泳圖
        4.2 目的片段的PCR電泳圖
        4.3 載體的構建
        4.4 A.nidulans的原生質體
        4.5 發(fā)酵產(chǎn)物HPLC-MS檢測
        4.6 利用液相色譜儀分離得到純品
        4.7 產(chǎn)物的抑菌實驗測試
        4.8 產(chǎn)物的抗腫瘤活性測試
    5 小結與討論
第四章 結論與展望
    4.1 結論
    4.2 展望
參考文獻
附錄
攻讀學位期間承擔的科研任務與主要成果
致謝
個人簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]蛹蟲草研究和開發(fā)過程中的一些問題和展望[J]. 文庭池,查嶺生,康冀川,Kevin D.HYDE.  菌物學報. 2017(01)
[2]蛹蟲草化學成分及藥理作用研究進展[J]. 樊慧婷,林洪生.  中國中藥雜志. 2013(15)



本文編號：3684611