本文通過改變培養(yǎng)條件、過表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和異源表達(dá)的策略,從嗜熱毀絲菌Myctlioehthora thermophila和蛹蟲草Cordyceps milltaris中發(fā)現(xiàn)和分離出了常規(guī)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下沒有的次級(jí)代謝產(chǎn)物,并對(duì)化合物性質(zhì)進(jìn)行了初步抑菌實(shí)驗(yàn)和抗腫瘤活性測(cè)試。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、通過改變M thermophila的培養(yǎng)溫度,在37℃ PDA培養(yǎng)條件下,分離出了文獻(xiàn)中未報(bào)道的化合物。在5 L發(fā)酵罐中（2個(gè)）進(jìn)行液體發(fā)酵共7 L,最后純化出該化合物。高分辨質(zhì)譜知道該化合物的分子式為C26H39NO4,分子量為429。核磁檢測(cè)得出該化合物為MyCyeliothermophin A的衍生物,其在8-C上多了一個(gè)-OH,與MyceliothermophinA一樣,其對(duì)各種腫瘤細(xì)胞也有毒性作用。其中對(duì)DLD-1的IC50為 1.47 μg/mL,對(duì)Hep3B的IC50為1.66 μg/mL,對(duì)HepG2的IC50為 1.73μg/mL,對(duì)HGC的IC50為0.32 μg/mL。2、利用過表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（TF）的策略,成功激活M thermophila原先沉默的NR-PKS基因簇。... 

【文章頁(yè)數(shù)】：92 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
中文文摘
緒論
    1 嗜熱毀絲菌Myceliphthora thermophila和蛹蟲草Cordyceps mliltaris簡(jiǎn)介
        1.1 嗜熱毀絲菌M.thermophila
        1.2 蛹蟲草C.militaris
    2 天然產(chǎn)物概述
        2.1 天然產(chǎn)物
        2.2 主要天然產(chǎn)物分類
    3 次級(jí)代謝基因簇
    4 沉默的基因簇
    5 天然產(chǎn)物基因組挖掘
        5.1 什么是基因組挖掘
        5.2 真菌中天然產(chǎn)物基因組挖掘
        5.3 天然產(chǎn)物基因組挖掘的常用策略
    6 課題研究的目的、主要內(nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)
        6.1 本課題的研究目的
        6.2 本課題的主要研究?jī)?nèi)容
        6.3 本課題的創(chuàng)新點(diǎn)
第一章 嗜熱毀絲菌 Myceliophthora thermophila的發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物的分離純化
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 菌株
        2.2 培養(yǎng)基
        2.3 試劑
        2.4 實(shí)驗(yàn)儀器
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 液體發(fā)酵嗜熱真菌M.thermophila
        3.2 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化
            3.2.1 發(fā)酵液的萃取
            3.2.2 發(fā)酵液的初分離
            3.2.3 利用液相色譜儀分離得到純品
        3.3 核磁檢測(cè)樣品的處理
        3.4 化合物的抗腫瘤活性測(cè)試
    4 結(jié)果與分析
        4.1 液體發(fā)酵嗜熱真菌M.hermophila
        4.2 利用液相色譜儀分離得到純品
        4.3 化合物1的抗腫瘤活性測(cè)試
    5 小結(jié)與討論
第二章 過表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子激活M.thermophila的沉默基因簇及其產(chǎn)物分離鑒定
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 菌株
        2.2 培養(yǎng)基
        2.3 試劑
        2.4 實(shí)驗(yàn)儀器
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 M. thermophila基因組的提取
        3.2 M. thermophila原生質(zhì)體的制備
        3.3 基因的擴(kuò)增
        3.4 DNA的瓊脂糖電泳
        3.5 PCR產(chǎn)物的膠回收
        3.6 載體的雙酶切
        3.7 目的片段與載體的連接(T4 Polymerase DNA assembly)
        3.8 大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.9 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        3.10 大腸桿菌質(zhì)粒的提取
        3.11 重組克隆載體的驗(yàn)證
        3.12 M.thermophila原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化
        3.13 表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)譜(LC-MS)檢測(cè)
        3.14 產(chǎn)物的大規(guī)模固體發(fā)酵與萃取
        3.15 產(chǎn)物的純化與結(jié)構(gòu)鑒定
        3.16 產(chǎn)物的抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)試
    4 結(jié)果與分析
        4.1 提取的M.hermophila基因組電泳圖
        4.2 目的片段(TF)的PCR電泳圖
        4.3 載體的構(gòu)建
        4.4 M. thermophila的原生質(zhì)體
        4.5 發(fā)酵產(chǎn)物HPLC-MS檢測(cè)
        4.6 利用液相色譜儀分離得到純品
        4.7 產(chǎn)物的抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)試
    5 小結(jié)與討論
第三章 異源表達(dá)蛹蟲草C.militaris的PKS-NRPS基因簇及其產(chǎn)物分離鑒定
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2 培養(yǎng)基
        2.3 試劑
        2.4 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.5 本實(shí)驗(yàn)所用到的per引物
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 C.militaris基因組的提取
        3.2 A.nidulans原生質(zhì)體的制備
        3.3 基因的擴(kuò)增
        3.4 DNA的瓊脂糖電泳和PCR產(chǎn)物的膠回收
        3.5 載體的雙酶切
        3.6 釀酒酵母BJ5464感受態(tài)的制備
        3.7 酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(質(zhì)粒的assembly構(gòu)建)
        3.8 酵母質(zhì)粒的提取
        3.9 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒的提取
        3.10 重組克隆載體的驗(yàn)證
        3.11 A.nidulans原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化
        3.12 表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)譜(LC-MS)檢測(cè)
        3.13 產(chǎn)物的大規(guī)模固體發(fā)酵與萃取
        3.14 產(chǎn)物的純化與結(jié)構(gòu)鑒定
        3.15 產(chǎn)物的抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)試
        3.16 產(chǎn)物的抗腫瘤測(cè)試
    4 結(jié)果與分析
        4.1 提取的C.militaris基因組電泳圖
        4.2 目的片段的PCR電泳圖
        4.3 載體的構(gòu)建
        4.4 A.nidulans的原生質(zhì)體
        4.5 發(fā)酵產(chǎn)物HPLC-MS檢測(cè)
        4.6 利用液相色譜儀分離得到純品
        4.7 產(chǎn)物的抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)試
        4.8 產(chǎn)物的抗腫瘤活性測(cè)試
    5 小結(jié)與討論
第四章 結(jié)論與展望
    4.1 結(jié)論
    4.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]蛹蟲草研究和開發(fā)過程中的一些問題和展望[J]. 文庭池,查嶺生,康冀川,Kevin D.HYDE.  菌物學(xué)報(bào). 2017(01)
[2]蛹蟲草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 樊慧婷,林洪生.  中國(guó)中藥雜志. 2013(15)



本文編號(hào)：3684611