1,2-氨基醇類化合物是一種重要的醫(yī)藥中間體,廣泛應用于神經(jīng)遞質(zhì)及抗病毒制劑等多種具有生理活性藥物的合成,因此探索1,2-氨基醇類化合物的高效合成方法對于發(fā)展該類藥物具有重要意義。與化學法相比,生物法由于其轉(zhuǎn)化率高,立體選擇性強,反應條件溫和等特點而得到廣泛關(guān)注。本研究基于新鑒定的Pseudomonas aeruginosa PAK來源的ω-轉(zhuǎn)氨酶（PAKω-TA）,設計了一個結(jié)合環(huán)氧化物水解酶（SpEH）和醇脫氫酶（MnADH）的多酶級聯(lián)催化體系,從而將較為廉價的環(huán)氧化合物一步催化合成具有高附加值的1,2-氨基醇類化合物;為了解決反應過程中的限速步驟,通過RBS優(yōu)化以提高醇脫氫酶在重組菌中的表達量;另外本研究在該級聯(lián)催化體系中引入大腸桿菌來源的谷氨酸脫氫酶（GluDH）,構(gòu)建了一個封閉的輔酶自循環(huán)系統(tǒng),從而實現(xiàn)輔酶NADP+和輔底物L-Glu的同時再生。（1）以Chromobacterium violaceumω-轉(zhuǎn)氨酶的蛋白序列作為基因探針,在基因數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對,P.aeruginosa PAK來源的“β-消除裂解酶家族蛋白”與C.violaceumω-轉(zhuǎn)氨酶具有... 

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 1,2-氨基醇類化合物的概述及合成方法
        1.1.1 1,2-氨基醇類化合物簡介
        1.1.2 1,2-氨基醇類化合物的化學合成
        1.1.3 1,2-氨基醇類化合物的化學酶法合成
        1.1.4 1,2-氨基醇類化合物的生物法合成
    1.2 ω-轉(zhuǎn)氨酶
        1.2.1 ω-轉(zhuǎn)氨酶簡介
        1.2.2 ω-轉(zhuǎn)氨酶的研究現(xiàn)狀
    1.3 環(huán)氧化物水解酶,醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶概述
        1.3.1 環(huán)氧化物水解酶
        1.3.2 醇脫氫酶
        1.3.3 谷氨酸脫氫酶
    1.4 輔酶自循環(huán)系統(tǒng)及多酶組裝
        1.4.1 輔酶自循環(huán)系統(tǒng)
        1.4.2 多酶組裝
    1.5 本課題的立題和主要研究內(nèi)容
        1.5.1 立題依據(jù)
        1.5.2 主要研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 引物設計
        2.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        2.1.4 主要實驗儀器
        2.1.5 主要實驗試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 基因組DNA和相關(guān)質(zhì)粒的提取
        2.2.2 目的基因的克隆
        2.2.3 重組質(zhì)粒和重組菌構(gòu)建
        2.2.4 關(guān)鍵酶的純化及酶活測定
        2.2.5 PAKω-TA酶學特性分析
        2.2.6 1,2-氨基醇酶催化體系的構(gòu)建
        2.2.7 底物,產(chǎn)物及中間產(chǎn)物濃度測定方法
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 PAKω-TA功能鑒定及酶學特性分析
        3.1.1 PAKω-TA酶基因pakω-ta的克隆表達與酶活測定
        3.1.2 PAKω-TA的酶學性質(zhì)
    3.2 多酶級聯(lián)催化合成1,2-氨基醇體系的構(gòu)建及驗證
        3.2.1 SpEH和 Mn ADH的克隆表達及酶活測定
        3.2.2 MnADH和 PAKω-TA兩酶串聯(lián)重組菌構(gòu)建
        3.2.3 SpEH、Mn ADH和 PAKω-TA三酶級聯(lián)催化體系驗證
    3.3 限速步驟的解除
        3.3.1 MnADH和 PAKω-TA的酶量配比優(yōu)化
        3.3.2 MnADH和 PAKω-TA表達量的調(diào)節(jié)與優(yōu)化
        3.3.3 重組菌轉(zhuǎn)化性能的對比
    3.4 輔酶自循環(huán)體系的構(gòu)建及篩選
        3.4.1 GluDH的克隆表達及酶活測定
        3.4.2 引入GluDH對多酶級聯(lián)催化反應的影響
        3.4.3 人工添加輔酶NADP+和輔底物L-Glu對多酶級聯(lián)催化反應的影響
        3.4.4 AlaDH與 GluDH催化效率比較
    3.5 共表達重組菌的構(gòu)建及全細胞催化合成1,2-氨基醇類化合物
        3.5.1 E.coli BL21(SMPG)重組菌構(gòu)建
        3.5.2 E.coli BL21(SGMP)全細胞生物催化合成(S)-2-氨基-1-苯基乙醇
        3.5.3 重組菌催化合成其他脂肪族類1,2-氨基醇驗證
主要結(jié)論與展望
致謝
參考文獻
附錄 :作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：3667357