秀麗線蟲（秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans）是第一個全基因組測序的多細胞生物,其60-80%的基因為人類同源基因,擁有約40%的人類疾病相關(guān)基因。熱休克反應與許多疾病相關(guān),如在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮保護作用。本文以以秀麗線蟲為模型、以海參c DNA文庫為基礎(chǔ)、以抗熱激能力為主要指標,在整體動物水平上建立從cDNA表達文庫篩選活性菌株的高通量篩選方法方法。主要結(jié)果如下:（1）高通量篩選平臺及篩選條件優(yōu)化。首先以96孔板和384孔板為基礎(chǔ),探索了溶液體積、細菌濃度、檢測時間等篩選條件,同時檢驗了秀麗線蟲對不同菌株的食物偏好性,然后針對相應條件摸索了熒光拍照和圖片分析條件,最終確定了整個篩選流程。在此過程中,將自動移液工作站、微型模式生物自動分選系統(tǒng)和高內(nèi)涵自動成像設(shè)備進行串聯(lián),有效用于高通量篩選。其中,移液工作站可實現(xiàn)批量精確加液,微型模式生物自動分選系統(tǒng)主要工作為精確分選秀麗線蟲至微孔板,高內(nèi)涵成像系統(tǒng)主要檢測微孔板內(nèi)秀麗線蟲的熒光強度并對數(shù)據(jù)進行分析。這些設(shè)備的應用和整合減少了重復性勞動和人為失誤,增加了實驗的可靠性,提高了篩選效率。（2）抗熱激菌株高通量篩選方法... 

【文章來源】：廣東藥科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

用于高通量篩選的秀麗線蟲表型

廣東藥科大學碩士研究生學位論文13本研究使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)的明場和FITC通道對經(jīng)過熱激脅迫的秀麗線蟲進行拍照并使用該系統(tǒng)內(nèi)的數(shù)據(jù)處理軟件分析數(shù)據(jù)。此外，我們也使用該設(shè)備的DAPI通道檢測秀麗線蟲脂褐素含量。圖1.2高通量儀器示意圖1.4研究意義熱休克反應是一種在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮保護作用的反應，是調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要靶標之一[104]。該反應通過產(chǎn)生多種熱休克蛋白保護機體免受高溫、氧化應激、重金屬等脅迫的傷害。傳統(tǒng)的藥物篩選方法篩選范圍窄、準確度低、指標單一，而在整體動物水平上篩選則需要大量人力物力。盡管由于小鼠與人類之間的遺傳聯(lián)系緊密，人們也對使用小鼠進行藥物測試非常感興趣，但此類研究費力、昂貴且對難以生成大量數(shù)據(jù)。秀麗線蟲被證明是在藥物發(fā)現(xiàn)過程初期的藥物和藥物測試應用的高度有利的生物學模型。盡管秀麗線蟲對人類的基因組匹配性比實驗室小鼠低，但許多疾病基因是人類和秀麗線蟲所共有的，而秀麗線蟲具有生命周期短、體積小和雌雄同體的優(yōu)勢，而且培養(yǎng)容易、價格低，可以用液體培養(yǎng)。本論文結(jié)合高通量儀器，采用以秀麗線蟲為模型的高通量篩選系統(tǒng)，以熱激為脅迫條件，大規(guī)模篩選海參cDNA文庫，構(gòu)建了篩選表達抗熱激蛋白的活性菌株的高通量篩選方法。1.5研究思路高通量篩選可以以特定的指標快速、高效的篩選化合物庫，尋找具有成藥潛力的化合物。根據(jù)實驗室前期構(gòu)建的海參cDNA文庫，結(jié)合實驗室現(xiàn)有的移液工作站、COPASBiosort和高內(nèi)涵成像設(shè)備三臺高通量篩選的儀器，以抗熱激能力為指標，使用秀麗線蟲整體動物模型，我們實現(xiàn)了對cDNA文庫的篩眩在過程中，利用自動移液工作站解決秀麗線蟲培養(yǎng)液、藥物、染料的大批量添加問題，利用COPASBiosort解決秀麗線蟲分選和狀態(tài)、數(shù)量的差異問題，利

廣東藥科大學碩士研究生學位論文14像設(shè)備解決大批量拍照和分析問題。首先將含有海參cDNA片段的質(zhì)粒導入到大腸桿菌中，加入誘導劑使該片段表達出蛋白。將已表達目的蛋白的大腸桿菌喂食秀麗線蟲一段時間后，加入熒光染料，進行熱激處理。最后使用高內(nèi)涵成像設(shè)備進行成像并分析熒光面積。SYTOXgreen熒光染料只能將死亡的秀麗線蟲染色，因此，熒光面積的大小與秀麗線蟲的死亡時間相關(guān)，秀麗線蟲死亡時間越晚，熒光面積便越小，表明秀麗線蟲可能食用含有表達蛋白的大腸桿菌后對熱激的抵抗能力增強。表達這種抗熱激蛋白的菌株正是我們需要篩選出的活性菌株。以下為實驗思路圖：圖1.1高通量篩選技術(shù)流程圖


本文編號：3625586