本文關(guān)鍵詞：計算機(jī)輔助設(shè)計高活性小分子新型SAHA衍生物及其合成與生物活性評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:組蛋白去乙�；敢种苿�(Histone Deacetylase Inhibitors,HDACi)憑借其靶點性強(qiáng)、臨床應(yīng)用廣泛、治療毒副作用相對較小等眾多優(yōu)勢獲得研究者的關(guān)注。多年來大量的臨床試驗結(jié)果證明HDACi對多種癌癥均有顯著的療效,雖然其抗癌作用機(jī)理仍未完全明了。但是,通過組蛋白乙�；揎椬饔糜绊懟蜣D(zhuǎn)錄活性和表達(dá)而發(fā)揮作用已經(jīng)得到很多研究確證。HDACi作用腫瘤細(xì)胞后能夠抑制腫瘤細(xì)胞中失調(diào)高度激活表達(dá)的組蛋白去乙�；�(Histone Deacetylases,HDACs),起到提升相應(yīng)的原抑癌基因的表達(dá)水平,從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞無限增值、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期檢查和凋亡,導(dǎo)致促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡�，F(xiàn)今已經(jīng)有許多HDACi抗癌藥物投入到了臨床試驗階段上,這些抑制劑中最早通過臨床試驗成功上市的SAHA已被美國所屬的食品藥物管理局(FDA)授權(quán)實際應(yīng)用于臨床各型腫瘤治療以及預(yù)防中,但十分讓人感到可惜的是現(xiàn)階段研究的HDACi絕大多數(shù)為非特異性組蛋白去乙�；敢种苿�(nonspecific-HDACi),這就造成了很多臨床治療中出現(xiàn)的副作用,所以導(dǎo)致HDACi在臨床上的使用也受到了相當(dāng)大的應(yīng)用限制。以經(jīng)典藥物伏立諾他(SAHA)類HDACi的結(jié)構(gòu)為母體結(jié)構(gòu),結(jié)合現(xiàn)代藥物設(shè)計方法-計算機(jī)輔助藥物設(shè)計(Computer-Aided Drug Design,CADD),設(shè)計、合成了一系列新型的SAHA類衍生物,對這些衍生物與HDAC酶的作用方式進(jìn)行了分析比較,并且對其進(jìn)行了抗腫瘤實驗生物活性評價以及其抗腫瘤的分子機(jī)制進(jìn)行研究和探討。希望通過對SAHA表面結(jié)構(gòu)區(qū)的修飾增加這類抑制劑對HDAC的抑制活性,減少其毒副作用。目的:根據(jù)經(jīng)典的組蛋白去乙酰化酶抑制SAHA的結(jié)構(gòu)特點和分子對接原理,采用計算機(jī)輔助設(shè)計小分子SAHA類衍生物結(jié)構(gòu),進(jìn)行化學(xué)合成,然后,通過細(xì)胞生物實驗,檢測其對HDACs的抑制活性、對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用以及對正常細(xì)胞的毒性作用,評價其作用于藥物靶點的能力、抗腫瘤活性和毒性作用。篩選出具有高活性、低毒性的HDACi,并且對其誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和自噬的分子機(jī)制進(jìn)行探討。方法:分子對接以HDAC8(PDB code 1T69)為篩選模型對比SAHA使用Autodocking等對接軟件進(jìn)行SAHA類衍生物-HDAC8酶活性對接。分析對接結(jié)果顯示,對接分?jǐn)?shù)比較高的衍生物在理論上能與HDAC8酶親和性更強(qiáng)。從而篩選出這些高分衍生物,通過酰胺反應(yīng)和異羥肟酸結(jié)合進(jìn)行合成。CCK-8的方法考察了這些衍生物對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性抑制作用以及對正常細(xì)胞的毒性作用,篩選濃度在0.1μM到30μM之間,研究細(xì)胞株為人膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGR2、U373、U251和人正常細(xì)胞肝細(xì)胞LO2、人正常肺細(xì)胞MRC5。使用Elisa方法考察了抑制劑對Beclin-1,Caspase-3,9和Bcl-2活性的影響。通過腹腔注射(I.P.)不同濃度的HDACi到小鼠體內(nèi),在不同時間點取小鼠腦和肺組織經(jīng)過研磨破碎,通過HPLC測定抑制劑濃度值,確認(rèn)HDACi是否能到達(dá)靶點器官;Bliss法測定藥物在小鼠中的LD50值,考察抑制劑對小鼠的毒副作用。結(jié)果:這些抑制劑在與HDAC8分子對接結(jié)果中均比陽性對照SAHA分?jǐn)?shù)高,理論上與靶點組蛋白去乙�；赣懈叩挠H和力;在體外抗膠質(zhì)腫瘤活性研究實驗檢測結(jié)果表明,這些新的SAHA類衍生物均能抑制HDACs和腫瘤細(xì)胞增殖,且作用敏感。對比陽性藥物SAHA其中以N3F,N2E,N25為代表化合物對于膠質(zhì)瘤的治療效果均強(qiáng)于SAHA表現(xiàn)更出色。呈現(xiàn)出對癌細(xì)胞高殺傷性,對正常人細(xì)胞低毒性的特點。尤其是化合物N3F和N2E表現(xiàn)出色,在U251細(xì)胞中N3F的IC50=0.1187μM,正常細(xì)胞中毒性低。構(gòu)效關(guān)系研究表明,通過對SAHA表面結(jié)構(gòu)區(qū)進(jìn)行修飾,能夠增強(qiáng)這些新衍生物對HDAC酶的抑制作用。其中N3F能明顯促進(jìn)Beclin-1,Caspase-3,9活性,抑制Bcl-2的活性。并且抑制Caspase酶活性后能明提升Beclin-1表達(dá)。N25小鼠體內(nèi)分布研究實驗中發(fā)現(xiàn)N25能穿過血腦屏障順利達(dá)到靶點器官(腦)從而發(fā)揮治療效果。而且N25在小鼠的毒性反應(yīng)實驗中呈較低毒性(LD50:240.840mg/kg)。以上結(jié)果表明對SAHA-Cap結(jié)構(gòu)的修改能得到高活性、低毒性的小分子化合物。結(jié)論:根據(jù)異羥肟酸類結(jié)構(gòu)特點設(shè)計、合成新型的SAHA衍生物,研究了其與HDAC8相互作用,并且對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了波普鑒定。針對膠質(zhì)瘤進(jìn)行了一系列細(xì)胞活性的篩選,選取較為敏感的細(xì)胞株進(jìn)行HDAC酶活性測定。篩選出活性更高活性的新型SAHA類構(gòu)造的HDACi。并對活性較高的化合物進(jìn)行了LD50測定。為今后治療膠質(zhì)瘤提供臨床候選藥物。
【關(guān)鍵詞】：分子對接 SAHA衍生物 合成 生物活性 LD50
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R914;TP391.72
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-15
• 1.1 膠質(zhì)瘤發(fā)展現(xiàn)狀10-11
• 1.2 組蛋白的乙酰化修飾與膠質(zhì)瘤的治療11-12
• 1.3 組蛋白去乙�；敢种苿┈F(xiàn)狀12-15
• 第二章SAHA類高活性小分子HDACi的設(shè)計、合成和結(jié)構(gòu)鑒定15-28
• 2.1 目標(biāo)化合物的設(shè)計思路15-23
• 2.1.1 SAHA類HDACi的分子模擬16
• 2.1.2 分子對接理論及常用方法16-17
• 2.1.3 AutoDock分子對接軟件17-18
• 2.1.4 本論文研究內(nèi)容18-19
• 2.1.5 HDACs與SAHA類HDACi的相互作用分析19
• 2.1.6 分子模擬方法19-21
• 2.1.6.1 抑制劑配體HDACi的構(gòu)建19
• 2.1.6.2 酶受體 HDACs 的構(gòu)建19-21
• 2.1.6.3 分子對接21
• 2.1.7 實驗結(jié)果21-23
• 2.2 目標(biāo)化合物的合成和結(jié)構(gòu)鑒定23-26
• 2.3 小結(jié)26-28
• 第三章 細(xì)胞抗增殖實驗28-31
• 3.1 細(xì)胞株28
• 3.2 實驗試劑28
• 3.3 細(xì)胞培養(yǎng)以及接種96孔板28
• 3.4 96 孔板給藥處理28-29
• 3.5 細(xì)胞增殖測定29
• 3.6 實驗結(jié)果29-30
• 3.7 小結(jié)30-31
• 第四章HDAC活性測定31-32
• 4.1 HDAC抑制率測試試劑盒(HDAC Inhibition Direct Assay Kit)31
• 4.2 試劑配制31
• 4.3 實驗步驟31
• 4.4 實驗結(jié)果31-32
• 第五章HDACi對凋亡和自噬通路相關(guān)蛋白的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)32-34
• 5.1 實驗?zāi)康募捌湓?/span>32
• 5.2 實驗準(zhǔn)備工作32
• 5.3 實驗方法32-33
• 5.4 Caspase活性抑制后測定Beclin-1 在U251 細(xì)胞中的含量變化33
• 5.5 計算33
• 5.6 實驗結(jié)果33
• 5.7 小結(jié)33-34
• 第六章 專利化合物N25 在小鼠體內(nèi)LD50 值測定以及在組織中的分布34-39
• 6.1 專利化合物N25 在小鼠體內(nèi)分布狀況34-36
• 6.2 LD50值測定36-37
• 6.3 實驗結(jié)果37-38
• 6.3.1 專利化合物N25 在小鼠腦內(nèi)分布結(jié)果37
• 6.3.2 專利化合物N25 在小鼠肺內(nèi)分布結(jié)果37-38
• 6.3.3 專利化合物N25 在小鼠體內(nèi)LD50值38
• 6.4 小結(jié)38-39
• 第七章 討論與總結(jié)39-45
• 第八章 實驗材料、試劑和儀器45-49
• 8.1 合成主要試劑和儀器45-47
• 8.2 細(xì)胞實驗主要試劑材料和儀器47-49
• 數(shù)據(jù)處理與分析49
• 財政支持49
• 科研成果49-50
• 致謝50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 附圖56-80

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