本文關(guān)鍵詞：基于代謝組學(xué)的白念珠菌對唑類藥物交叉耐藥機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白念珠菌引起的侵襲性真菌感染率和死亡率與日俱增,給臨床抗真菌感染治療帶來很大困擾。唑類藥物,尤其是氟康唑,因其安全性高、療效好和副作用小而成為防治真菌感染的一線藥物,但其僅具有抑菌作用,因此在長期治療過程中產(chǎn)生了耐藥性,使其對氟康唑耐藥的同時對其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶點不同的抗真菌藥物也產(chǎn)生耐藥性。近年來,耐藥菌的出現(xiàn)使真菌防治治療雪上加霜。因此,研究白念珠菌對唑類藥物的交叉耐藥機制顯得迫切重要。代謝組學(xué)旨在從整體角度表征機體的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其研究特點與白念珠菌復(fù)雜的耐藥機制不謀而合。在本課題組前期研究基礎(chǔ)上,我將進行代謝足跡分析和磷脂代謝組學(xué)分析,從而完善白念珠菌代謝組學(xué)研究平臺,為了驗證該平臺的有效性,我們將其用于白念珠菌對唑類藥物交叉耐藥機制及紫草素抗被膜型白念珠菌作用機制研究：針對磷脂的結(jié)構(gòu)特點及其特征碎片離子,構(gòu)建親水作用色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(HILIC-QQQ/MS)。在對色譜質(zhì)譜條件和提取方法優(yōu)化的基礎(chǔ)上,將該方法成功應(yīng)用于白念珠菌磷脂代謝組學(xué)研究。結(jié)果表明,磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺是含量較多的兩類磷脂,C16:0、C16:1、C17:1、C18:0、C18:1、C18:2和C18：3是白念珠菌中的主要脂肪酸。給藥組中PE(32：2)含量顯著降低,而脂肪酸不飽和指數(shù)顯著升高,表明兩性霉素B可能通過影響細胞膜流動性和破壞細胞膜的穩(wěn)定性而發(fā)揮抗真菌作用,從另一角度證明兩性霉素B的作用靶點位于細胞膜。該方法的建立為后續(xù)的白念珠菌對唑類藥物的交叉耐藥機制研究奠定基礎(chǔ)。采用UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS高通量分析技術(shù)相結(jié)合的代謝組學(xué)方法對白念珠菌細胞內(nèi)和細胞外代謝物分別進行代謝指紋分析和代謝足跡分析,從多層次、多角度、最大限度的獲取樣品中的有效信息的基礎(chǔ)上,進一步細化差異代謝物產(chǎn)生的原因,通過多元統(tǒng)計學(xué)方法分析得到25個菌株不同生物標志物、43個敏感菌藥物應(yīng)激相關(guān)標志物、45個耐藥菌藥物應(yīng)激相關(guān)標志物和20個菌株耐藥強弱相關(guān)標志物,把菌株是否耐藥做為因素A,把給藥與否做為因素B,采用雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)其中25個相關(guān)標志物是交互作用產(chǎn)生的。這些標志物主要涉及氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、應(yīng)激代謝、磷脂代謝和鞘脂代謝。進一步采用HILIC-QQQ/MS對白念珠菌耐藥相關(guān)通路進行代謝靶標分析,挖掘與耐藥密切相關(guān)的磷脂。這些發(fā)現(xiàn)揭示了耐藥菌可能通過增強對外界刺激的抵抗力、降低細胞內(nèi)活性氧、增強藥物外轉(zhuǎn)運蛋白的過表達、改變細胞膜流動性、破壞細胞膜穩(wěn)定性以及影響線粒體功能來降低對抗真菌藥物的敏感性,從而達到抗真菌藥物作用。我們以被膜型白念珠菌為研究對象,建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的代謝組學(xué)方法來研究中藥活性單體紫草素抗被膜型白念珠菌的代謝調(diào)控機制,通過多元統(tǒng)計學(xué)分析篩選到19個紫草素給藥相關(guān)的生物標志物,主要涉及氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、糖酵解、能量代謝、脂肪酸代謝和應(yīng)激反應(yīng),這一結(jié)果表明紫草素可能是通過調(diào)控這些代謝通路發(fā)揮對被膜型白念珠菌的抗真菌作用。本論文首次采用UPLC-Q-TOF/MS、GC-MS和HILIC-QQQ/MS多種分析技術(shù)相結(jié)合的方法從多層次、多角度、最大限度獲取樣品信息的基礎(chǔ)上,對白念珠菌進行代謝組學(xué)研究,從而更全面、更精確的闡明白念珠菌對唑類藥物交叉耐藥機制和紫草素抗被膜型白念珠菌代謝調(diào)控機制,為新型抗真菌藥物的研發(fā)提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：代謝組學(xué) 白念珠菌 唑類藥物 交叉耐藥 紫草素 磷脂代謝組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-17
• 第一章 基于HILIC-QQQ/MS建立白念珠菌磷脂代謝組學(xué)分析方法17-27
• 一、實驗部分18-21
• (一) 試劑18
• (二) 菌株和培養(yǎng)基18
• (三) 儀器18-19
• (四) LC-QQQ/MS條件19
• (五) 混合內(nèi)標溶液的配制19
• (六) 樣品制備19-20
• (七) 數(shù)據(jù)處理20-21
• 二、實驗結(jié)果21-25
• (一) 6種甘油磷脂的色譜圖21
• (二) 提取回收率21-22
• (三) HILIC-QQQ/MS色譜圖22-23
• (四) 樣品測定23-25
• 三、討論25-26
• 四、本章小結(jié)26-27
• 第二章 基于代謝組學(xué)的白念珠菌對唑類藥物交叉耐藥機制的研究27-57
• 一、實驗部分27-33
• (一) 試劑27
• (二) 菌株和培養(yǎng)基27-28
• (三) 儀器28-29
• (四) 樣品制備29-30
• (五) GC-MS分析30-31
• (六) UPLC-Q-TOF/MS分析31-32
• (七) HILIC-QQQ/MS分析32
• (八) 數(shù)據(jù)處理32-33
• 二、實驗結(jié)果33-48
• (一) 氟康唑耐藥菌的產(chǎn)生33
• (二) GC-MS、UPLC-Q-TOF/MS和HILIC-QQQ/MS代謝輪廓33-36
• (三) 細胞內(nèi)潛在生物標志物的篩選和鑒別36-40
• (四) 細胞外潛在生物標志物的篩選和鑒別40-47
• (五) 磷脂代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析47-48
• 三、討論48-55
• (一) 菌株不同相關(guān)標志物49-51
• (二) 敏感菌藥物應(yīng)激相關(guān)標志物51-52
• (三) 耐藥菌藥物應(yīng)激相關(guān)標志物52-53
• (四) 菌株耐藥強弱相關(guān)標志物53-54
• (五) 交互作用產(chǎn)生的相關(guān)標志物54-55
• (六) 磷脂代謝組學(xué)研究55
• 四、本章小結(jié)55-57
• 第三章 基于GC-MS技術(shù)的紫草素作用白念珠菌生物被膜的代謝組學(xué)研究57-67
• 一、實驗部分57-60
• (一) 試劑57
• (二) 菌株和培養(yǎng)基57-58
• (三) 儀器58
• (四) 樣品制備58-59
• (五) 樣品前處理59
• (六) 數(shù)據(jù)處理59-60
• 二、結(jié)果60-64
• (一) GC-MS代謝輪廓60-61
• (二) 數(shù)據(jù)分析61-64
• 三、討論64-65
• 四、本章小結(jié)65-67
• 總結(jié)67-69
• 參考文獻69-80
• 綜述：脂質(zhì)組學(xué)在微生物領(lǐng)域中的研究進展80-89
• 參考文獻86-89
• 在讀期間發(fā)表文章和參加科研工作情況89-90
• 致謝90

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本文編號：335043