本文關(guān)鍵詞：基于代謝組學(xué)的白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物交叉耐藥機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白念珠菌引起的侵襲性真菌感染率和死亡率與日俱增,給臨床抗真菌感染治療帶來(lái)很大困擾。唑類(lèi)藥物,尤其是氟康唑,因其安全性高、療效好和副作用小而成為防治真菌感染的一線藥物,但其僅具有抑菌作用,因此在長(zhǎng)期治療過(guò)程中產(chǎn)生了耐藥性,使其對(duì)氟康唑耐藥的同時(shí)對(duì)其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶點(diǎn)不同的抗真菌藥物也產(chǎn)生耐藥性。近年來(lái),耐藥菌的出現(xiàn)使真菌防治治療雪上加霜。因此,研究白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的交叉耐藥機(jī)制顯得迫切重要。代謝組學(xué)旨在從整體角度表征機(jī)體的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其研究特點(diǎn)與白念珠菌復(fù)雜的耐藥機(jī)制不謀而合。在本課題組前期研究基礎(chǔ)上,我將進(jìn)行代謝足跡分析和磷脂代謝組學(xué)分析,從而完善白念珠菌代謝組學(xué)研究平臺(tái),為了驗(yàn)證該平臺(tái)的有效性,我們將其用于白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物交叉耐藥機(jī)制及紫草素抗被膜型白念珠菌作用機(jī)制研究：針對(duì)磷脂的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其特征碎片離子,構(gòu)建親水作用色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(HILIC-QQQ/MS)。在對(duì)色譜質(zhì)譜條件和提取方法優(yōu)化的基礎(chǔ)上,將該方法成功應(yīng)用于白念珠菌磷脂代謝組學(xué)研究。結(jié)果表明,磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺是含量較多的兩類(lèi)磷脂,C16:0、C16:1、C17:1、C18:0、C18:1、C18:2和C18：3是白念珠菌中的主要脂肪酸。給藥組中PE(32：2)含量顯著降低,而脂肪酸不飽和指數(shù)顯著升高,表明兩性霉素B可能通過(guò)影響細(xì)胞膜流動(dòng)性和破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性而發(fā)揮抗真菌作用,從另一角度證明兩性霉素B的作用靶點(diǎn)位于細(xì)胞膜。該方法的建立為后續(xù)的白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的交叉耐藥機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。采用UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS高通量分析技術(shù)相結(jié)合的代謝組學(xué)方法對(duì)白念珠菌細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外代謝物分別進(jìn)行代謝指紋分析和代謝足跡分析,從多層次、多角度、最大限度的獲取樣品中的有效信息的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步細(xì)化差異代謝物產(chǎn)生的原因,通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析得到25個(gè)菌株不同生物標(biāo)志物、43個(gè)敏感菌藥物應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物、45個(gè)耐藥菌藥物應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物和20個(gè)菌株耐藥強(qiáng)弱相關(guān)標(biāo)志物,把菌株是否耐藥做為因素A,把給藥與否做為因素B,采用雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)其中25個(gè)相關(guān)標(biāo)志物是交互作用產(chǎn)生的。這些標(biāo)志物主要涉及氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、應(yīng)激代謝、磷脂代謝和鞘脂代謝。進(jìn)一步采用HILIC-QQQ/MS對(duì)白念珠菌耐藥相關(guān)通路進(jìn)行代謝靶標(biāo)分析,挖掘與耐藥密切相關(guān)的磷脂。這些發(fā)現(xiàn)揭示了耐藥菌可能通過(guò)增強(qiáng)對(duì)外界刺激的抵抗力、降低細(xì)胞內(nèi)活性氧、增強(qiáng)藥物外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)表達(dá)、改變細(xì)胞膜流動(dòng)性、破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性以及影響線粒體功能來(lái)降低對(duì)抗真菌藥物的敏感性,從而達(dá)到抗真菌藥物作用。我們以被膜型白念珠菌為研究對(duì)象,建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的代謝組學(xué)方法來(lái)研究中藥活性單體紫草素抗被膜型白念珠菌的代謝調(diào)控機(jī)制,通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析篩選到19個(gè)紫草素給藥相關(guān)的生物標(biāo)志物,主要涉及氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、糖酵解、能量代謝、脂肪酸代謝和應(yīng)激反應(yīng),這一結(jié)果表明紫草素可能是通過(guò)調(diào)控這些代謝通路發(fā)揮對(duì)被膜型白念珠菌的抗真菌作用。本論文首次采用UPLC-Q-TOF/MS、GC-MS和HILIC-QQQ/MS多種分析技術(shù)相結(jié)合的方法從多層次、多角度、最大限度獲取樣品信息的基礎(chǔ)上,對(duì)白念珠菌進(jìn)行代謝組學(xué)研究,從而更全面、更精確的闡明白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物交叉耐藥機(jī)制和紫草素抗被膜型白念珠菌代謝調(diào)控機(jī)制,為新型抗真菌藥物的研發(fā)提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：代謝組學(xué) 白念珠菌 唑類(lèi)藥物 交叉耐藥 紫草素 磷脂代謝組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-17
• 第一章 基于HILIC-QQQ/MS建立白念珠菌磷脂代謝組學(xué)分析方法17-27
• 一、實(shí)驗(yàn)部分18-21
• (一) 試劑18
• (二) 菌株和培養(yǎng)基18
• (三) 儀器18-19
• (四) LC-QQQ/MS條件19
• (五) 混合內(nèi)標(biāo)溶液的配制19
• (六) 樣品制備19-20
• (七) 數(shù)據(jù)處理20-21
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-25
• (一) 6種甘油磷脂的色譜圖21
• (二) 提取回收率21-22
• (三) HILIC-QQQ/MS色譜圖22-23
• (四) 樣品測(cè)定23-25
• 三、討論25-26
• 四、本章小結(jié)26-27
• 第二章 基于代謝組學(xué)的白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物交叉耐藥機(jī)制的研究27-57
• 一、實(shí)驗(yàn)部分27-33
• (一) 試劑27
• (二) 菌株和培養(yǎng)基27-28
• (三) 儀器28-29
• (四) 樣品制備29-30
• (五) GC-MS分析30-31
• (六) UPLC-Q-TOF/MS分析31-32
• (七) HILIC-QQQ/MS分析32
• (八) 數(shù)據(jù)處理32-33
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-48
• (一) 氟康唑耐藥菌的產(chǎn)生33
• (二) GC-MS、UPLC-Q-TOF/MS和HILIC-QQQ/MS代謝輪廓33-36
• (三) 細(xì)胞內(nèi)潛在生物標(biāo)志物的篩選和鑒別36-40
• (四) 細(xì)胞外潛在生物標(biāo)志物的篩選和鑒別40-47
• (五) 磷脂代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析47-48
• 三、討論48-55
• (一) 菌株不同相關(guān)標(biāo)志物49-51
• (二) 敏感菌藥物應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物51-52
• (三) 耐藥菌藥物應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物52-53
• (四) 菌株耐藥強(qiáng)弱相關(guān)標(biāo)志物53-54
• (五) 交互作用產(chǎn)生的相關(guān)標(biāo)志物54-55
• (六) 磷脂代謝組學(xué)研究55
• 四、本章小結(jié)55-57
• 第三章 基于GC-MS技術(shù)的紫草素作用白念珠菌生物被膜的代謝組學(xué)研究57-67
• 一、實(shí)驗(yàn)部分57-60
• (一) 試劑57
• (二) 菌株和培養(yǎng)基57-58
• (三) 儀器58
• (四) 樣品制備58-59
• (五) 樣品前處理59
• (六) 數(shù)據(jù)處理59-60
• 二、結(jié)果60-64
• (一) GC-MS代謝輪廓60-61
• (二) 數(shù)據(jù)分析61-64
• 三、討論64-65
• 四、本章小結(jié)65-67
• 總結(jié)67-69
• 參考文獻(xiàn)69-80
• 綜述：脂質(zhì)組學(xué)在微生物領(lǐng)域中的研究進(jìn)展80-89
• 參考文獻(xiàn)86-89
• 在讀期間發(fā)表文章和參加科研工作情況89-90
• 致謝90

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本文編號(hào)：335043