實驗?zāi)康?作為常見的消化道惡性腫瘤,食管鱗癌在全世界范圍有著高發(fā)病率兼死亡率�；颊叽_診時往往在中晚期,預(yù)后差,五年生存率低,且他們通常要承受化療藥物帶來的毒副反應(yīng)。本課題組近年來合成的化合物TZY2與TZY是抗腫瘤活性比較好的萘酰亞胺-多胺綴合物。本課題將人源性食管鱗癌細胞KYSE-30、KYSE-150、EC-9706作為主要研究對象,探究化合物TZY2與TZY抑制食管鱗癌的作用和機制。實驗方法:采用MTT法和CCK-8法檢測化合物TZY2與TZY作用下食管鱗癌細胞的生存率;采用食管鱗癌細胞的平板克隆實驗,觀察TZY2作用下細胞的集落形成;使用倒置熒光顯微鏡檢測化合物TZY2與TZY在食管鱗癌細胞中是否具有熒光并觀察TZY2與TZY的熒光強度;在激光共聚焦顯微鏡下采集化合物TZY2與TZY在食管鱗癌細胞中的熒光成像;使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng),檢測TZY2與TZY在食管鱗癌細胞中的熒光值;采用Lyso-Tracker Red、Golgi-Tracker Red、ER-Tracker Red等染料標記在化合物作用下的食管鱗癌細胞,并在共聚焦顯微鏡下分析化合物與細胞器的共定位,以及檢測化合物TZ... 

【文章來源】：河南大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 食管鱗癌的研究
    1.2 萘酰亞胺衍生物的研究
    1.3 多胺的研究
    1.4 溶酶體的功能
    1.5 本課題研究目的和意義
第2章 實驗材料
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗細胞株
        2.1.2 實驗器材
    2.2 主要實驗試劑的配制
        2.2.1 配制主要細胞培養(yǎng)試劑
        2.2.2 配制染料工作液
        2.2.3 配制Western blot實驗試劑
        2.2.4 配制化合物TZY2與TZY溶液
    2.3 實驗試劑
        2.3.1 細胞培養(yǎng)類
        2.3.2 染料試劑類
        2.3.3 Western blot實驗類
    2.4 實驗儀器
第3章 實驗方法
    3.1 食管鱗癌細胞的培養(yǎng)
        3.1.1 細胞復(fù)蘇
        3.1.2 細胞傳代
        3.1.3 細胞凍存
    3.2 MTT法測食管鱗癌細胞的增殖
        3.2.1 MTT法檢測TZY2和TZY對食管鱗癌細胞增殖的影響
        3.2.2 Baf-A1與TZY2 聯(lián)用對食管鱗癌細胞生存率的影響
    3.3 CCK-8 實驗驗證TZY2和TZY的作用
    3.4 細胞的克隆形成實驗
    3.5 倒置熒光顯微鏡成像
        3.5.1 TZY2和TZY熒光性質(zhì)的研究
        3.5.2 臺盼藍(trypan blue)染色法
        3.5.3 Caspase-3 活性檢測試劑盒檢測TZY2 作用下食管鱗癌細胞的凋亡
    3.6 FACSort流式細胞儀
        3.6.1 AnnexinⅤ/PI雙染檢測TZY2 作用下食管鱗癌細胞的凋亡
        3.6.2 TZY2作用食管鱗癌細胞PI染色的熒光強度
        3.6.3 Rh123染色檢測TZY2對食管鱗癌細胞線粒體跨膜電位的影響
        3.6.4 MDC染色檢測TZY2 對食管鱗癌細胞自噬的作用
    3.7 高內(nèi)涵活細胞成像系統(tǒng)
        3.7.1 食管鱗癌細胞中TZY2與TZY的熒光強度
        3.7.2 DND-189 溶酶體探針染色檢測TZY2 對食管鱗癌細胞溶酶體熒光強度和p H的改變
    3.8 共聚焦顯微鏡與超高分辨率顯微成像
        3.8.1 共聚焦顯微鏡拍攝TZY2與TZY的熒光成像
        3.8.2 TZY2與TZY與食管鱗癌細胞器共定位分析
        3.8.3 TZY2與TZY作用下細胞中溶酶體的成像
    3.9 細胞劃痕實驗
    3.10 Western blot
        3.10.1 收集食管鱗癌細胞
        3.10.2 提取總蛋白
        3.10.3 Western blot詳細操作
    3.11 統(tǒng)計學(xué)方法
第4章 實驗結(jié)果
    4.1 TZY2和TZY對食管鱗癌細胞增殖的影響
        4.1.1 MTT法檢測TZY2、TZY對 KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 細胞存活率的影響
        4.1.2 CCK-8 法驗證TZY2、TZY能抑制三種食管鱗癌細胞的增殖
        4.1.3 TZY2有效抑制食管鱗癌細胞的集落形成
    4.2 TZY2和TZY在食管鱗癌細胞中的熒光成像
        4.2.1 TZY2在KYSE-30、KYSE-150 細胞中的熒光情況
        4.2.2 TZY在 KYSE-30、KYSE-150 細胞中的熒光情況
    4.3 TZY2和TZY在食管鱗癌細胞中的熒光強度檢測
        4.3.1 熒光顯微鏡拍攝在KYSE-150和EC-9706 細胞中,TZY2 熒光強度大于TZY熒光強度
        4.3.2 共聚焦顯微鏡顯示KYSE-30、KYSE-150 細胞中TZY2 熒光強度大于TZY
        4.3.3 高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)檢測KYSE-30、KYSE-150 細胞中熒光強度
    4.4 TZY2和TZY在食管鱗癌細胞中的靶向性測定
        4.4.1 TZY2在食管鱗癌細胞中定位于溶酶體
        4.4.2 TZY在 KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 細胞中靶向溶酶體
    4.5 TZY2和TZY對食管鱗癌細胞中溶酶體的影響
        4.5.1 在KYSE-30 細胞中分別加入TZY2和TZY后溶酶體的變化
        4.5.2 在KYSE-150 細胞中分別加入TZY2和TZY后溶酶體的變化
        4.5.3 TZY2對KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 中溶酶體熒光強度和p H的改變
    4.6 TZY2對食管鱗癌細胞凋亡的影響
        4.6.1 Trypan blue染色檢測TZY2 作用下KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 的細胞活力
        4.6.2 AnnexinⅤ/PI雙染和PI染色檢測在TZY2 作用下KYSE-30、KYSE-150、EC-9706細胞的凋亡
        4.6.3 Caspase-3 活性檢測試劑盒測試TZY2 作用下食管鱗癌活細胞的凋亡情況
    4.7 TZY2對食管鱗癌細胞線粒體跨膜電位的影響
    4.8 TZY2對食管鱗癌細胞自噬的影響
        4.8.1 采用MDC染色檢測KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 細胞在TZY2 作用下自噬體數(shù)量的改變
        4.8.2 Baf-A1 減弱TZY2對KYSE-30、KYSE-150、EC-9706 細胞的抑制作用
    4.9 TZY2對食管鱗癌細胞遷移的影響
    4.10 Western Blot檢測TZY2 對食管鱗癌細胞中蛋白表達的影響
        4.10.1 TZY2對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
        4.10.2 TZY2對自噬相關(guān)蛋白表達的影響
        4.10.3 TZY2對溶酶體相關(guān)蛋白表達的影響
第5章 實驗討論
第6章 實驗結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]多胺在癌癥治療中的作用及機制[J]. 馬容,陳咨余,姜冬梅,康波.  生物技術(shù)通報. 2016(02)



本文編號：3300881