發(fā)布時間：2017-04-15 19:25

  本文關鍵詞：2型囊泡谷氨酸轉運體與神經(jīng)病理性疼痛的相關性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景谷氨酸在疼痛信號的傳遞和調控過程中發(fā)揮關鍵作用。已有大量研究證實,神經(jīng)病理性疼痛與谷氨酸過度釋放有關。囊泡谷氨酸轉運體(vesicular glutamate transporters,VGLUTs),負責將胞內的谷氨酸攝取入囊泡,完成谷氨酸的儲存、隔離和釋放,因此對突觸間隙的谷氨酸動態(tài)平衡具有重要影響。在VGLUTs的3個亞型中,2型囊泡谷氨酸轉運體(vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2)主要表達于脊髓、丘腦和低位腦干,在一些杏仁核和皮層結構中也有表達,提示VGLUT2可能參與了疼痛信號的傳遞和加工。近期的研究發(fā)現(xiàn)VGLUT2表達降低的小鼠神經(jīng)病理性疼痛表現(xiàn)消失或減弱,同時VGLUT2表達降低導致丘腦神經(jīng)元興奮性突觸后電流幅度和頻率下降,進一步表明VGLUT2與神經(jīng)病理性疼痛相關。盡管如此,神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中VGLUT2的表達是否發(fā)生改變,VGLUT2的表達變化如何影響谷氨酸能神經(jīng)傳遞,抑制VGLUT2的功能能否對抗疼痛等等還鮮有報道。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)病理痛大鼠的背根神經(jīng)節(jié)、脊髓中VGLUT2的表達上調,本研究重點關注神經(jīng)病理痛進程中小鼠腦內VGLUT2的表達和功能變化,以及VGLUT抑制劑對谷氨酸釋放和疼痛行為的影響。研究目的研究神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中小鼠腦內VGLUT2表達與功能的改變及其影響疼痛信息傳遞的機制,觀察VGLUT抑制劑功能對動物疼痛反應和谷氨酸釋放的影響。研究方法第一部分是建立神經(jīng)病理性疼痛模型,觀察不同時間點疼痛相關腦區(qū)VGLUT2表達的改變,探討VGLUT2表達改變對谷氨酸囊泡攝取和釋放的影響。包括:1)建立坐骨神經(jīng)選擇性損傷(spared nerve injury,SNI)模型:結扎并剪斷C57小鼠坐骨神經(jīng)三個分支中的腓總神經(jīng)和脛神經(jīng),保持腓腸神經(jīng)不受損傷。術后以Von Frey法測試動物腓腸神經(jīng)支配域機械痛閾的變化。2)VGLUT2表達檢測:于SNI造模后不同時間(0.5,1,1.5,3,7,14,28天)取小鼠全腦,采用免疫組織化學法檢測丘腦、水管周圍灰質(Periaqueductal gray,PAG)、雙側杏仁核和雙側內側前額葉皮層(medial prefrontal cortex,m PFC)中VGLUT2表達的改變。3)VGLUT2功能檢測:在囊泡谷氨酸攝取實驗中,分別于SNI造模后1天和14天,分離丘腦突觸囊泡并與系列濃度的谷氨酸共同孵育,應用微透析和HPLC-ECD測定孵育液中谷氨酸濃度的變化,以此反映谷氨酸的囊泡攝取;在突觸體谷氨酸釋放實驗中,分別于SNI造模后1天和14天,制備丘腦突觸體,與谷氨酸脫氫酶及NADP+共孵育,通過熒光酶標儀檢測反應產(chǎn)物NADPH的熒光強度,以確定孵育液中谷氨酸濃度。第二部分是選擇系列VGLUT功能抑制劑作為工具藥,研究抑制劑對神經(jīng)痛小鼠機械痛閾和丘腦谷氨酸釋放的影響,以及對疼痛相關腦區(qū)神經(jīng)元c-Fos表達的影響;觀察抑制劑對動物運動協(xié)調能力與其他疼痛行為的影響。包括1)抑制VGLUT功能對疼痛的影響:在SNI和奧沙利鉑誘發(fā)神經(jīng)痛的形成期或維持期,腦室給藥VGLUT抑制劑,觀察動物機械痛閾的變化。2)對運動協(xié)調性和其他疼痛的作用:采用轉棒實驗研究VGLUT抑制劑腦室給藥對動物運動協(xié)調性的影響,并在小鼠熱板模型、福爾馬林模型及醋酸扭體模型上對抑制劑進行作用研究。3)對c-Fos表達的影響:免疫組化法檢測抑制劑對SNI術后早期腦內c-Fos表達的影響。4)突觸體谷氨酸釋放的測定:SNI造模后1天提取動物的丘腦突觸體,與VGLUT抑制劑共孵育,熒光酶標儀檢測抑制劑對動物去極化引發(fā)的谷氨酸釋放的影響。研究結果1)SNI術后VGLUT2表達和功能的改變SNI造模后1天,丘腦、PAG和雙側杏仁核中VGLUT2表達均顯著升高,從造模后1.5天開始到28天VGLUT2表達逐漸下降到假手術水平;SNI術后1天,小鼠丘腦突觸體囊泡的谷氨酸攝取速率,在外加谷氨酸濃度為1000μM和2000μM時顯著升高,而SNI術后14天的谷氨酸攝取速率沒有明顯變化;SNI術后1天,小鼠丘腦突觸體去極化引發(fā)的谷氨酸釋放明顯升高,在術后14天,谷氨酸的釋放與假手術組相比沒有明顯差別。2)VGLUT抑制劑對神經(jīng)痛疼痛反應的影響SNI損傷后立即腦室注射VGLUT抑制劑CSB6B(5μg/只)、Rose Bengal(5μg/只)、Xanthurenic Acid(10μg/只)、Brilliant Yellow(5μg/只)之后每12小時注射一次,與溶劑組(a CSF,5μl/只)相比,能顯著抑制SNI術后0.5天和1天的動物機械痛閾下降,而在SNI術后的疼痛維持期,CSB6B和Rose Bengal(5μg,i.c.v.)沒有明顯的鎮(zhèn)痛作用;在奧沙利鉑致神經(jīng)痛模型上,造模同時每12小時CSB6B(5μg,i.c.v.)伴隨給藥,與模型組相比,能夠明顯抑制奧沙利鉑第一次給藥后1.5到4天的動物機械痛閾下降。CSB6B(1 mg·kg-1,i.p.)預防或治療性給藥對SNI誘發(fā)的機械痛敏均無顯著的鎮(zhèn)痛作用。3)VGLUT抑制劑對對運動協(xié)調性和其他疼痛的影響動物運動協(xié)調功能的研究表明,CSB6B(5μg,i.c.v.)對小鼠的轉棒掉落潛伏期沒有明顯影響。CSB6B(2.5 mg·kg-1,i.p.)對小鼠50和55℃的熱板反應沒有明顯的影響;CSB6B(2.5 mg·kg-1,i.p.)作用30 min和60 min能夠明顯抑制醋酸引發(fā)的小鼠扭體反應;CSB6B(0.5 mg·kg-1,i.p.)作用30 min后能夠明顯降低小鼠福爾馬林模型的二相舔足時間,而對福爾馬林一相疼痛沒有明顯影響。4)VGLUT抑制劑對神經(jīng)痛c-Fos表達和谷氨酸釋放的影響c-Fos表達的檢測結果表明,丘腦、PAG在SNI術后1天,PAG和對側m PFC在SNI術后1.5天時,與假手術組相比,模型組神經(jīng)元c-Fos的表達明顯上升;與模型組相比,CSB6B(5μg,i.c.v.)能夠明顯降低丘腦在SNI術后0.5天與對側m PFC在術后1.5天的c-Fos表達。進一步實驗表明,CSB6B與SNI術后丘腦突觸體共孵育30 min后能夠明顯抑制突觸的谷氨酸釋放,IC50為25.7μM。結論神經(jīng)病理性疼痛早期腦內VGLUT2表達升高,同時丘腦神經(jīng)元囊泡谷氨酸攝取和突觸體谷氨酸釋放能力均顯著增強,提示VGLUT2在神經(jīng)痛早期發(fā)揮了作用。VGLUT功能抑制劑不影響動物運動協(xié)調能力,卻可緩解動物神經(jīng)痛早期的機械痛敏,抑制神經(jīng)痛誘導的c-Fos表達。VGLUT的作用機制可能與抑制丘腦突觸體谷氨酸釋放有關。本研究結果表明,神經(jīng)病理性疼痛可引起腦內VGLUT2的表達和功能發(fā)生改變,VGLUT抑制劑可延緩痛敏形成。
【關鍵詞】：神經(jīng)病理性疼痛 VGLUT2 丘腦 CSB6B
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生過程中腦內VGLUT2表達和功能的變化17-34
• 材料和方法17-24
• 1 實驗材料17-18
• 2 實驗方法18-24
• 2.1 行為學測試18
• 2.2 坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（SNI）模型18
• 2.3 免疫組織化學實驗18-20
• 2.4 谷氨酸囊泡攝取實驗20-22
• 2.5 突觸體谷氨酸釋放實驗22-24
• 實驗結果24-34
• 1 SNI術后動物痛閾值的變化24
• 2 選取腦區(qū)示意圖24-25
• 3 SNI術后不同時間點各腦區(qū)VGLUT2表達的變化25-30
• 3.1 SNI術后不同時間點丘腦VGLUT2表達的變化25-26
• 3.2 SNI術后不同時間點PAG中VGLUT2表達的變化26-27
• 3.3 SNI術后不同時間點雙側杏仁核中VGLUT2表達的變化27-28
• 3.4 SNI術后不同時間點雙側m PFC中VGLUT2表達的變化28-30
• 4 SNI術后不同時間點丘腦突觸囊泡谷氨酸攝取功能的變化30-33
• 5 SNI術后不同時間點小鼠丘腦突觸體谷氨酸釋放量的變化33-34
• 第二部分 抑制VGLUT2功能對神經(jīng)病理性疼痛及其他類型疼痛的影響34-56
• 材料和方法34-38
• 1 實驗材料34-35
• 2 實驗方法35-38
• 2.1 側腦室置管手術35
• 2.2 化療藥致神經(jīng)痛模型35
• 2.3 小鼠熱板實驗35-36
• 2.4 小鼠醋酸扭體實驗36
• 2.5 小鼠福爾馬林實驗36
• 2.6 小鼠轉棒實驗36
• 2.7 SNI造模及機械痛閾值檢測36
• 2.8 免疫組織化學實驗36-37
• 2.9 突觸體谷氨酸釋放實驗37
• 2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計37-38
• 實驗結果38-56
• 1 VGLUT抑制劑（CSB6B）對神經(jīng)痛疼痛反應的影響38-43
• 1.1 CSB6B腹腔注射在SNI模型不同階段的作用研究38-39
• 1.2 在SNI模型不同階段腦室注射VGLUTs抑制劑的作用研究39-42
• 1.3 在化療藥致神經(jīng)痛模型上腦室注射CSB6B對動物機械痛閾的影響42-43
• 2 CSB6B對動物運動協(xié)調性和其他類型疼痛的作用43-48
• 2.1 CSB6B腦室注射對動物運動協(xié)調性的影響43-44
• 2.2 CSB6B腦室注射在其他疼痛模型中的作用研究（前期實驗結果）44-46
• 2.3 CSB6B腹腔注射在其他疼痛模型中的作用研究46-48
• 3 神經(jīng)痛過程中CSB6B對c-Fos表達和谷氨酸釋放的影響48-56
• 3.1 SNI術后早期不同時間點CSB6B對各腦區(qū)c-Fos表達的影響48-53
• 3.2 神經(jīng)痛過程中CSB6B對突觸體谷氨酸釋放的影響53-56
• 討論56-60
• 結論60-61
• 參考文獻61-68
• 綜述68-73
• 參考文獻70-73
• 個人簡歷73-74
• 致謝74

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