本文關(guān)鍵詞：sFcγRⅡb蛋白表達(dá)及其結(jié)合肽篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：FcγRIIb為免疫球蛋白超家族成員,是唯一的抑制型Fc受體,主要通過與激活型受體交聯(lián)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制信號(hào),對(duì)于體內(nèi)的免疫平衡發(fā)揮著重要的作用。以FcγRIIb為靶點(diǎn)進(jìn)行的研究對(duì)于探索自身免疫性疾病、感染以及腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)疾病的藥物開發(fā)具有重要意義。本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了FcγRIIb蛋白胞外區(qū)并利用噬菌體肽庫展示技術(shù)篩選FcγRIIb結(jié)合肽,主要分為以下兩部分:第一部分:s FcγRIIb基因克隆與表達(dá)。提取RBL-2H3細(xì)胞總RNA,采用RT-PCR技術(shù)克隆FcγRIIb基因,構(gòu)建了克隆載體FcγRIIb-p UCm-T。我們亞克隆FcγRIIb胞外區(qū)基因,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒s FcγRIIb-p ET17b,采用Ca Cl2介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒s FcγRIIb-p ET17b轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,進(jìn)行表達(dá)。通過對(duì)表達(dá)體系進(jìn)行優(yōu)化,確定IPTG濃度為1.0m M,誘導(dǎo)時(shí)間為4h時(shí)蛋白表達(dá)效率最高。SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)Triton X-100和2M尿素清洗后,8M尿素溶液溶解,利用Ni-NTA柱親和層析獲得了較高純度的重組蛋白。采用梯度透析復(fù)性法對(duì)s FcγRIIb進(jìn)行復(fù)性后,經(jīng)Western Blot和ELISA法鑒定,結(jié)果表明重組蛋白s FcγRIIb能被特異性抗體所識(shí)別且與Ig G在體外具有結(jié)合能力,表明成功制備了具有正常生物學(xué)功能的重組蛋白。第二部分:s FcγRIIb結(jié)合肽篩選。采用噬菌體肽庫展示技術(shù)對(duì)s FcγRIIb結(jié)合肽進(jìn)行篩選。利用ELISA鑒定每輪洗脫噬菌體與s FcγRIIb蛋白親和力,經(jīng)過四輪篩選,挑取40個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行序列測(cè)定,得到28種不同的十二肽序列。采用ELISA法鑒定噬菌體與s FcγRIIb蛋白的結(jié)合活性,獲得了與s FcγRIIb蛋白高親和力和高特異性結(jié)合的結(jié)合肽:FHKMPWYMSMYY、WHNPMWWSWNKN、MSHHSYYRDPFA、WHTTWPFWIVNS、LMAPHSHYVVRM。本研究成功制備了具生物學(xué)活性的重組蛋白s FcγRIIb,獲得了高特異性、高親和力的s FcγRIIb蛋白結(jié)合肽,為進(jìn)一步研究結(jié)合肽功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：sFcγRIIb 噬菌體展示技術(shù) 結(jié)合肽
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 前言11-18
• 1.1 FcγRIIb研究進(jìn)展11-16
• 1.1.1 Fc受體（FcR）11
• 1.1.2 FcγRIIb基因與蛋白結(jié)構(gòu)11-12
• 1.1.3 可溶性FcγRIIb12
• 1.1.4 FcγRIIb的生物學(xué)功能12-13
• 1.1.5 FcγRIIb與疾病相關(guān)13-15
• 1.1.6 FcγRIIb在疾病治療中的作用15-16
• 1.2 噬菌體展示技術(shù)研究進(jìn)展16-17
• 1.2.1 噬菌體展示技術(shù)16-17
• 1.2.2 噬菌體篩選多肽藥物展望17
• 1.3 本研究的研究目的、內(nèi)容與意義17-18
• 第2章 sFcγIIb蛋白的表達(dá)及活性鑒定18-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-21
• 2.1.1 細(xì)胞系18
• 2.1.2 菌種和質(zhì)粒18
• 2.1.3 主要試劑18
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備18-19
• 2.1.5 主要溶液19-21
• 2.1.6 培養(yǎng)基21
• 2.2 sFcγIIb原核表達(dá)載體的構(gòu)建21-25
• 2.2.1 總RNA的提取21
• 2.2.2 反轉(zhuǎn)錄21-22
• 2.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成22
• 2.2.4 FcγIIB基因片段的PCR擴(kuò)增22-23
• 2.2.5 目的基因FcγIIB與T載體的連接23
• 2.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：23-24
• 2.2.7 sFcγIIB基因片段的擴(kuò)增24
• 2.2.8 目的基因sFcγIIB與pET17b載體的連接24-25
• 2.2.9 重組質(zhì)粒pET-17b-sFcγIIB的雙酶切鑒定25
• 2.3 sFcγIIb蛋白的表達(dá)與純化25-29
• 2.3.1 利用軟件在線對(duì)重組蛋白sFcγRIIb理化性質(zhì)進(jìn)行分析25
• 2.3.2 sFcγIIb蛋白的表達(dá)25-26
• 2.3.3 重組蛋白的純化26
• 2.3.4 重組蛋白的復(fù)性26-27
• 2.3.5 Western Blot27
• 2.3.6 ELISA27-29
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-38
• 2.4.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建29-32
• 2.4.2 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化32-38
• 2.5 討論38-40
• 第3章 sFcγRIIb蛋白結(jié)合肽的篩選40-50
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 3.1.1 試劑40
• 3.1.2 噬菌體篩選材料40-41
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法41-45
• 3.2.1 噬菌體滴度的測(cè)定41
• 3.2.2 噬菌體肽庫淘選41-42
• 3.2.3 第二、三、四輪噬菌體淘選42-43
• 3.2.4 每輪洗脫噬菌體與sFcγRIIb蛋白親和力的鑒定43
• 3.2.5 噬菌斑的擴(kuò)增43
• 3.2.6 噬菌體DNA的提取43-44
• 3.2.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)噬菌體DNA44
• 3.2.8 單鏈?zhǔn)删wDNA序列的測(cè)定44
• 3.2.9 氨基酸序列同源性分析44
• 3.2.10 噬菌體與sFcγRIIb親和力的ELISA鑒定44-45
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-48
• 3.3.1 篩選噬菌體回收率結(jié)果45
• 3.3.2 每輪噬菌體篩選后洗脫物與sFcγRIIb蛋白的結(jié)合45-46
• 3.3.3 挑取噬菌體單克隆并提取DNA46-47
• 3.3.4 單鏈?zhǔn)删wDNA序列測(cè)定結(jié)果47-48
• 3.3.5 噬菌體單克隆親和力鑒定48
• 3.3.6 氨基酸序列同源性分析結(jié)果48
• 3.4 討論48-50
• 第4章 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 致謝56

【參考文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 封雪;苦蕎10kDa過敏原的重組表達(dá)及性質(zhì)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：sFcγRⅡb蛋白表達(dá)及其結(jié)合肽篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：288454