本文關(guān)鍵詞：降血壓活性肽的融合表達(dá)及純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：高血壓疾病是造成心腦血管疾病死亡的主要原因,隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的變化,高血壓疾病的患病率呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢。市場上用于治療高血壓的藥物種類繁多,常見的有復(fù)方降壓片、利血平等口服降血壓藥物,但是臨床發(fā)現(xiàn)其存在副作用,容易引起心率減慢或者增快的癥狀。因此,以天然生物大分子——蛋白質(zhì)為來源制備的降血壓活性肽逐漸成為研究熱點(diǎn),它具有安全無毒、無副作用、對正常血壓無影響且降壓效果溫和等優(yōu)勢。其作用機(jī)理是抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的活性,從而降低患者的血壓。目前降血壓活性肽的制備主要是采用蛋白酶水解法、微生物發(fā)酵法和基因工程法。其中,人們已經(jīng)利用蛋白酶水解法和微生物發(fā)酵法成功分離鑒定出大量的降血壓活性肽,但是酶水解產(chǎn)物成分往往過于復(fù)雜導(dǎo)致后續(xù)分離純化過程困難,且適用的發(fā)酵菌種種類稀少,在一定程度上制約了這兩種方法的發(fā)展。近期的研究結(jié)果表明,基因工程法在制備降血壓活性肽方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿?但該法在技術(shù)實(shí)現(xiàn)方面還存在一些問題,限制其在實(shí)際操作中的應(yīng)用。從基因表達(dá)角度來分析,一方面降血壓活性肽序列通常較短,容易被工程菌體內(nèi)蛋白酶降解,導(dǎo)致單體肽無法實(shí)現(xiàn)直接表達(dá);另一方面由于蛋白質(zhì)常常不能正確折疊而形成包涵體,復(fù)性過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。從蛋白純化角度來分析,蛋白酶往往不能有效識別酶切位點(diǎn),純化標(biāo)簽去除困難。此外,親和純化介質(zhì)較昂貴,一般要進(jìn)行多步純化,存在成本高、步驟繁瑣和有毒試劑的使用等問題。針對基因工程法制備降血壓活性肽存在的問題,本論文根據(jù)胃腸道消化酶的酶切特性和降血壓活性肽的構(gòu)效關(guān)系,選取經(jīng)體內(nèi)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)實(shí)驗(yàn)或者體外胃腸消化模擬實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有高活性的降血壓活性肽,采用高效釋放的串聯(lián)結(jié)構(gòu)作為連接片段,將20種降血壓活性肽單體串聯(lián)成降血壓活性肽多聚體(AHPM),對AHPM基因優(yōu)化分析后進(jìn)行基因合成。其次構(gòu)建重組表達(dá)載體p ET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM,轉(zhuǎn)化宿主菌株,命名為大腸桿菌BL21(DE3)/p ET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM�；驕y序結(jié)果顯示AHPM被插入到L2(252-273)純化標(biāo)簽的下游,在AHPM與L2(252-273)純化標(biāo)簽之間有SUMO增溶標(biāo)簽,組成L2(252-273)-SUMO雙融合標(biāo)簽。再將重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),研究結(jié)果表明,最適表達(dá)條件為37℃培養(yǎng)至菌液OD600值1.0,加入0.1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),降溫至30℃誘導(dǎo)7 h,在此條件下,重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM的表達(dá)量為254 mg/L發(fā)酵液,并且95%以上是以可溶形式表達(dá)。最后采用L2(252-273)-SUMO雙融合標(biāo)簽純化重組AHPM。利用L2(252-273)純化標(biāo)簽與硅藻土助濾劑STD(簡稱硅藻土)之間強(qiáng)烈的特異性吸附作用,將硅藻土與含有重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM的細(xì)胞破碎上清溶液混合,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,溫度為25℃,震蕩速率為150 r/min,反應(yīng)時(shí)間為2.0 h時(shí),吸附率達(dá)到94.50%。接下來經(jīng)過重組SUMO蛋白酶(Ulp1-K10)的酶切作用后,L2(252-273)-SUMO雙融合標(biāo)簽和Ulp1-K10均被吸附到硅藻土上,AHPM被分離出來,AHPM得率可達(dá)31.68 mg/L發(fā)酵液。同時(shí)模擬兩步胃腸消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,胃蛋白酶消化水解液以及胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶復(fù)合蛋白酶水解液均表現(xiàn)出較強(qiáng)的ACE抑制活性,其IC50值分別為56.22±1.03μg/m L和56.10±1.05μg/m L。本論文采用有效的串聯(lián)策略、高效的表達(dá)系統(tǒng)和簡易的純化方法,成功純化出高活性的降血壓活性肽,為降血壓活性肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一個(gè)簡便的方法,也為基因工程法制備其他生物活性肽提供了新的研究思路。
【關(guān)鍵詞】：降血壓活性肽 降血壓活性肽多聚體 L2(252-273)-SUMO-AHPM 硅藻土 ACE抑制活性
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R915;O629.72
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 緒論9-19
• 1.1 高血壓與降血壓活性肽理論9-11
• 1.1.1 高血壓與人類健康的關(guān)系9
• 1.1.2 降血壓活性肽理論9-11
• 1.2 降血壓活性肽制備方法概述11-14
• 1.2.1 蛋白酶水解法制備降血壓活性肽11-12
• 1.2.2 微生物發(fā)酵法制備降血壓活性肽12-13
• 1.2.3 基因工程法制備降血壓活性肽13-14
• 1.3 降血壓活性肽多聚體的表達(dá)策略14-16
• 1.3.1 降血壓活性肽的表達(dá)方式14-15
• 1.3.2 降血壓活性肽的表達(dá)系統(tǒng)15-16
• 1.4 降血壓活性肽多聚體的純化16-17
• 1.4.1 降血壓活性肽的傳統(tǒng)純化方法16
• 1.4.2 降血壓活性肽的新型純化方法16-17
• 1.5 立題背景及意義17-18
• 1.6 主要研究內(nèi)容18-19
• 2 材料和方法19-26
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-20
• 2.1.1 菌株和培養(yǎng)基19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 主要儀器和設(shè)備19-20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-26
• 2.2.1 降血壓活性肽單體的篩選20-21
• 2.2.2 降血壓活性肽多聚體的設(shè)計(jì)思路與基因合成21
• 2.2.3 分子克隆實(shí)驗(yàn)21
• 2.2.4 重組表達(dá)載體pET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM的構(gòu)建21-22
• 2.2.5 重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM的誘導(dǎo)表達(dá)22
• 2.2.6 重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化22
• 2.2.7 重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上的吸附特性研究22-23
• 2.2.8 重組SUMO蛋白酶在陽離子交換樹脂上的吸附特性研究23-24
• 2.2.9 AHPM的純化24
• 2.2.10 體外胃腸消化模擬實(shí)驗(yàn)24
• 2.2.11 SDS-PAGE24-25
• 2.2.12 蛋白濃度的測定25
• 2.2.13 多肽濃度的測定25
• 2.2.14 ACE抑制率測定25-26
• 3 結(jié)果與討論26-40
• 3.1 降血壓活性肽多聚體基因的設(shè)計(jì)、優(yōu)化與合成26-29
• 3.1.1 降血壓活性肽多聚體基因的設(shè)計(jì)26-27
• 3.1.2 降血壓活性肽多聚體基因的優(yōu)化分析27-28
• 3.1.3 降血壓活性肽多聚體基因的合成28-29
• 3.2 重組表達(dá)載體pET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM的構(gòu)建29-31
• 3.2.1 攜帶目的基因質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證29
• 3.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增29-30
• 3.2.3 重組表達(dá)載體的雙酶切鑒定30
• 3.2.4 重組表達(dá)載體pET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM構(gòu)建完成30-31
• 3.3 重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM的表達(dá)鑒定31-32
• 3.4 重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化32-34
• 3.4.1 IPTG濃度單因素實(shí)驗(yàn)32
• 3.4.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)單因素實(shí)驗(yàn)32
• 3.4.3 誘導(dǎo)溫度單因素實(shí)驗(yàn)32
• 3.4.4 誘導(dǎo)時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)32-34
• 3.5 重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上的吸附研究34-35
• 3.5.1 pH對重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上吸附的影響34
• 3.5.2 吸附容量對重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上吸附的影響34
• 3.5.3 吸附時(shí)間對重組蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上吸附的影響34-35
• 3.6 重組SUMO蛋白酶的純化35-37
• 3.6.1 重組SUMO蛋白酶吸附時(shí)間的研究35-36
• 3.6.2 重組SUMO蛋白酶的梯度洗脫36-37
• 3.7 降血壓活性肽多聚體的純化37-39
• 3.8 降血壓活性肽多聚體的活性鑒定39-40
• 主要結(jié)論與展望40-42
• 致謝42-43
• 參考文獻(xiàn)43-49
• 附錄: 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文49

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 郭丹;;飲食因素與高血壓的研究進(jìn)展[J];包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2014年01期

2 趙金蘭;用玉米渣生產(chǎn)降血壓活性肽[J];食品與機(jī)械;1998年05期

3 王小莉;劉冬;梁世中;;降血壓肽基因工程菌的構(gòu)建及高效表達(dá)策略[J];中國生物工程雜志;2008年03期

4 邱華麗;潘曉彥;;高血壓病防治研究現(xiàn)狀[J];世界中西醫(yī)結(jié)合雜志;2014年02期

5 王勇;李水明;何曼文;鄒永東;;蛋白質(zhì)胰蛋白酶水解過程雙位點(diǎn)漏切肽段的質(zhì)譜鑒定[J];質(zhì)譜學(xué)報(bào);2013年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 饒勝其;降血壓活性肽的篩選及其前體多肽的設(shè)計(jì)、克隆表達(dá)與活性鑒定[D];江南大學(xué);2011年

2 王偉;可控酶解蠶蛹蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽及其構(gòu)效關(guān)系的研究[D];浙江大學(xué);2008年

3 李俊華;小泛素樣修飾物介導(dǎo)的純化技術(shù)研究及其應(yīng)用[D];江南大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王冠超;重組膽固醇氧化酶的表達(dá)與純化研究[D];江南大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：降血壓活性肽的融合表達(dá)及純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：288834