本文關(guān)鍵詞：海洋生物天然活性成分與細(xì)胞的相互作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：從海洋生物中尋找和篩選具有藥用價(jià)值的活性先導(dǎo)化合物是藥物研發(fā)的一個(gè)重要趨勢(shì)。而海洋藥物研發(fā)的第一步就是活性成分的篩選。傳統(tǒng)的藥物篩選都是以抗菌實(shí)驗(yàn)、體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)考察藥物的生理作用,具有步驟繁瑣,要求高,時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。本文根據(jù)海洋生物活性成分與腫瘤細(xì)胞相互作用的可能機(jī)理,建立了海洋藥物活性成分篩選的新方法。首先,以已知生物活性的中藥為模式天然藥物,建立分析方法及活性測(cè)試方法,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。采用HPLC分別對(duì)紅花超純水提取物中的羥基紅花黃色素A以及延胡索超純水提取物中的延胡索乙素進(jìn)行了定性定量分析。在此基礎(chǔ)上,選用常見的人類HepG2肝癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用CCK-8法探討了羥基紅花黃色素A(HSYA)及延胡索乙素體外對(duì)細(xì)胞活力的影響。HSYA和延胡索乙素作用于HepG2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本相符,證明該方法可用于天然生物活性成分的分離及活性測(cè)試。其次,使用HPLC-RID以及HPLC-MS聯(lián)用儀器,分別對(duì)13種海洋天然生物的水提物中的物質(zhì)進(jìn)行探究。選取超純水和乙腈作為流動(dòng)相,采用RID檢測(cè)器與等度洗脫程序,對(duì)海洋生物提取物進(jìn)行分離,結(jié)果5種樣品檢測(cè)出峰,其中GG07和KG04分離效果良好。選取超純水和甲醇作為流動(dòng)相,采用質(zhì)譜法對(duì)海洋生物提取物中的進(jìn)行初步測(cè)定。結(jié)合HPLC與質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果,推測(cè)海洋生物提取物中應(yīng)該含有海洋多糖類物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上,采用HPLC-MS法分析了殼聚糖樣品KG04、海綿提取物樣品HJ12中某一分子量成分與大腸桿菌及金黃色葡萄球菌相互作用的特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),殼寡糖KG04中分子量為531的物質(zhì)和海綿提取物樣品HJ12中分子量為403的物質(zhì)與大腸桿菌細(xì)胞以及金黃色葡萄球菌相互作用的結(jié)合率均不高,隨濃度升高并無(wú)太大變化。采用HPLC-MS法分析了海綿提取物樣品HJ12中分子量為401和431與人類肝癌細(xì)胞HepG2相互作用的特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),海綿提取物樣品HJ12中分子量為403和海綿水提物中431的樣品與HepG2肝癌細(xì)胞相互作用前后的結(jié)合率隨樣品濃度的增大而增大。因此,海綿提取物樣品HJ12和海綿水提物可能會(huì)有促腫瘤凋亡或致死作用。再次,為驗(yàn)證海洋生物活性物質(zhì)與微生物間及與腫瘤細(xì)胞相互作用與抗菌活性、抗腫瘤之間關(guān)系,進(jìn)行了抗菌活性測(cè)試和抗腫瘤活性測(cè)試。根據(jù)抑菌試驗(yàn)結(jié)果,在實(shí)驗(yàn)濃度下,12種海洋生物提取物與大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作用24h后,培養(yǎng)皿上均沒有抑菌圈出現(xiàn)。選用CCK-8法及Annexin V-FTIC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)法探究了海綿提取物樣品HJ12中分子量為403和海綿水提物中431的樣品對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞活性影響,發(fā)現(xiàn)隨海綿水提物濃度的增加,HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。早期凋亡及晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量都表現(xiàn)出良好的一致性,說(shuō)明這兩種活性物質(zhì)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡模式。與第三章中的結(jié)合率實(shí)驗(yàn)相比,活性物質(zhì)與腫瘤細(xì)胞間的結(jié)合率越高,表現(xiàn)出的促凋亡作用越明顯。在此基礎(chǔ)上,考察了其他多種來(lái)源于不同海洋生物的提取物的抗腫瘤細(xì)胞活性�？偨Y(jié)如下:紅藻寡糖樣品QJ03、異麥芽寡糖樣品YM06、珊瑚提取物樣品SS10和珊瑚提取物樣品SM11在實(shí)驗(yàn)濃度作用下,正常細(xì)胞群與凋亡細(xì)胞群數(shù)量并未發(fā)生明顯改變,無(wú)增殖現(xiàn)象,細(xì)胞凋亡率維持在穩(wěn)定的低水平,說(shuō)明QJ03、YM06、SS10和SM11對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯作用。紅藻寡糖樣品KL02在實(shí)驗(yàn)濃度作用下,細(xì)胞凋亡率明顯有所增加,但是細(xì)胞的凋亡率先減少后增加,原因有待進(jìn)一步研究。褐藻寡糖樣品HZ01、殼寡糖樣品KG04、木寡糖樣品MG05、果寡糖樣品GG07、海馬提取物樣品SB08、海馬提取物樣品CC09、海綿提取物樣品HJ12和海綿水提物在實(shí)驗(yàn)濃度作用下,細(xì)胞的凋亡率有所提高。而且,隨濃度的提高,HZ01、MG05、GG07、CC09幾種樣品的促凋亡率并沒有進(jìn)一步提高;而SB08的促凋亡率在低濃度時(shí)沒有太大變化,高濃度時(shí)表現(xiàn)良好的促凋亡作用。與此不同的是,KG04樣品隨濃度的升高,其促凋亡率隨之升高,表現(xiàn)在良好的應(yīng)用前景。本研究工作的創(chuàng)新之處在于使用HPLC-MS聯(lián)用,建立海洋生物活性成分與細(xì)菌、腫瘤細(xì)胞體外相互作用的指紋分析方法,并發(fā)現(xiàn)活性成分與細(xì)菌及腫瘤細(xì)胞間的結(jié)合率與海洋生物活性成分的抗菌活性、抗腫瘤細(xì)胞活性表現(xiàn)出一致性。計(jì)算活性成分與不同細(xì)胞間相互作用后的結(jié)合率,可用于表征海洋生物活性成分的抗腫瘤活性,為海洋藥物的篩選提供了一種快速的、簡(jiǎn)單的方法。
【關(guān)鍵詞】：海洋生物活性成分 液質(zhì)連用 相互作用 結(jié)合率 抗腫瘤活性
【學(xué)位授予單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R915
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 1 緒論12-24
• 1.1 引言12
• 1.2 天然藥物活性12-13
• 1.3 抗腫瘤活性成分13-17
• 1.3.1 中藥抗腫瘤活性成分13-16
• 1.3.1.1 黃酮類13-14
• 1.3.1.2 揮發(fā)油14
• 1.3.1.3 多糖類14
• 1.3.1.4 多肽類14-15
• 1.3.1.5 生物堿15
• 1.3.1.6 有機(jī)酸15
• 1.3.1.7 其他15-16
• 1.3.2 海洋藥物抗腫瘤活性成分16-17
• 1.3.2.1 活性肽類16
• 1.3.2.2 多糖類16
• 1.3.2.3 大環(huán)內(nèi)脂類16-17
• 1.3.2.4 生物堿類17
• 1.3.2.5 萜類17
• 1.3.2.6 其他17
• 1.4 抑菌活性成分17-19
• 1.4.1 中藥抑菌活性成分18-19
• 1.4.1.1 黃酮類18
• 1.4.1.2 揮發(fā)油18
• 1.4.1.3 生物堿18
• 1.4.1.4 有機(jī)酸18-19
• 1.4.1.5 其他19
• 1.4.2 海洋藥物抑菌活性成分19
• 1.5 天然藥物與細(xì)胞相互作用方法19-21
• 1.5.1 藥物與細(xì)胞相互作用19-20
• 1.5.2 藥物與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)相互作用20-21
• 1.5.2.1 酶20
• 1.5.2.2 核酸20
• 1.5.2.3 線粒體20
• 1.5.2.4 其他20-21
• 1.6 細(xì)胞檢測(cè)主要技術(shù)和意義21-22
• 1.6.1 顯微鏡技術(shù)21
• 1.6.2 電泳法21-22
• 1.6.3 MTT法22
• 1.6.4 流式細(xì)胞術(shù)22
• 1.6.5 其他22
• 1.7 論文研究思路與意義22-24
• 2 天然藥物與細(xì)胞相互作用活性表征方法的建立24-36
• 2.1 引言24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分24-29
• 2.2.1 試劑藥品與儀器設(shè)備24-26
• 2.2.1.1 試劑藥品和儀器設(shè)備24-26
• 2.2.1.2 細(xì)胞株26
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)條件與方法26-29
• 2.2.2.1 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的配制26
• 2.2.2.2 色譜條件26-27
• 2.2.2.3 工作曲線的繪制27
• 2.2.2.4 培養(yǎng)基的制備與Hep G2肝癌細(xì)胞27
• 2.2.2.5 中藥活性成分對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活性影響的研究27-29
• 2.3 結(jié)果與討論29-35
• 2.3.1 色譜條件選擇29-30
• 2.3.1.1 紅花中活性成分的紫外-可見光譜圖分析29
• 2.3.1.2 延胡索中活性成分的紫外-可見光譜圖分析29-30
• 2.3.2 紅花的定性定量分析30-31
• 2.3.2.1 紅花中的活性成分定性分析30
• 2.3.2.2 紅花中的活性成分定量分析30-31
• 2.3.3 延胡索的定性定量分析31-33
• 2.3.3.1 延胡索中的活性成分定性分析31-32
• 2.3.3.2 延胡索中的活性成分定量分析32-33
• 2.3.4 CCK-8 法檢測(cè)中藥活性成分對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞的活力影響33-35
• 2.3.4.1 羥基紅花黃色素A對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活性影響的研究33-34
• 2.3.4.2 延胡索乙素對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活性影響的研究34-35
• 2.4 結(jié)論35-36
• 3 海洋生物活性成分與細(xì)菌及腫瘤細(xì)胞結(jié)合率的測(cè)定36-56
• 3.1 引言36-37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分37-51
• 3.2.1 試劑材料與儀器設(shè)備37-38
• 3.2.1.1 本章所使用到的試劑材料37-38
• 3.2.1.2 細(xì)胞株38
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)條件與方法38-39
• 3.2.2.1 海綿水溶性樣品溶液的配置38-39
• 3.2.2.2 海洋生物提取物樣品的配置39
• 3.2.2.3 色譜條件39
• 3.2.3 海洋生物活性成分與細(xì)菌結(jié)合率的測(cè)定39-40
• 3.2.3.1 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基及相互作用菌種的制備39-40
• 3.2.3.2 結(jié)合率的測(cè)定40
• 3.2.3.3 結(jié)合率的計(jì)算40
• 3.2.4 海洋生物活性成分與腫瘤細(xì)胞結(jié)合率的測(cè)定40-41
• 3.2.4.1 培養(yǎng)基的制備與Hep G2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)40
• 3.2.4.2 細(xì)胞接種40
• 3.2.4.3 加入樣品處理及結(jié)合率測(cè)定40-41
• 3.2.5 海洋生物提取物中活性成分的定性分析41-51
• 3.2.5.1 海洋生物提取物HPLC的RID檢測(cè)譜圖41-43
• 3.2.5.2 海洋生物提取物HPLC-MS檢測(cè)譜圖43-51
• 3.3 海洋生物活性成分對(duì)細(xì)菌活性的影響51-53
• 3.3.1 海洋生物活性成分與細(xì)菌的相互作用51-53
• 3.3.1.1 殼寡糖樣品KG04與細(xì)菌相互作用51-52
• 3.3.1.2 海綿提取物樣品HJ12與細(xì)菌相互作用52-53
• 3.4 海洋生物活性成分與腫瘤細(xì)胞的相互作用53-55
• 3.4.1 海洋生物活性成分與Hep G2肝癌細(xì)胞的相互作用53-55
• 3.4.1.1 海綿提取物HJ12與Hep G2肝癌細(xì)胞相互作用54
• 3.4.1.2 海綿水提物與Hep G2肝癌細(xì)胞相互作用54-55
• 3.5 結(jié)論55-56
• 4 海洋生物活性成分的抗菌活性和抗腫瘤細(xì)胞活性56-72
• 4.1 引言56
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分56-60
• 4.2.1 試劑材料與儀器設(shè)備56-58
• 4.2.1.1 本章所使用到的試劑材料56-58
• 4.2.1.2 細(xì)胞株58
• 4.2.2 樣品配置58
• 4.2.2.1 海綿水溶性樣品溶液的配置58
• 4.2.2.2 海洋生物提取物樣品的配置58
• 4.2.3 海洋生物提取物對(duì)細(xì)菌活性影響的研究58-59
• 4.2.3.1 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基及相互作用菌種的制備58-59
• 4.2.3.2 抑菌實(shí)驗(yàn)59
• 4.2.4 海洋生物提取物對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活性影響的研究59-60
• 4.2.4.1 培養(yǎng)基的制備與Hep G2肝癌細(xì)胞59
• 4.2.4.2 CCK-8 法檢測(cè)樣品對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活性的影響59-60
• 4.2.4.3 Annexin V-FITC/PI流式雙染術(shù)檢測(cè)樣品對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活性的影響60
• 4.3 結(jié)果與討論60-70
• 4.3.1 抑菌實(shí)驗(yàn)60-61
• 4.3.2 CCK-8 法檢測(cè)海洋生物提取物對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活力的影響61-63
• 4.3.2.1 藻類寡糖樣品組對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活力的影響61-62
• 4.3.2.2 寡糖類樣品組對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活力的影響62-63
• 4.3.2.3 海洋動(dòng)物提取物樣品組對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活力的影響63
• 4.3.3 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞雙染術(shù)檢測(cè)海洋生物提取物對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活性的影響63-70
• 4.3.3.1 海綿提取物HJ12對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活力的影響64
• 4.3.3.2 海洋動(dòng)物提取物樣品組對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活力的影響64-67
• 4.3.3.3 藻類寡糖樣品組對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活力的影響67-68
• 4.3.3.4 寡糖類樣品組對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞活力的影響68-70
• 4.4 結(jié)論70-72
• 5 總結(jié)72-74
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文79-82
• 致謝82

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1 胡莎莎;共生菌來(lái)源的新活性物質(zhì)研究[D];南京大學(xué);2015年

2 錢杏杏;CD4~+NKG2D~+T細(xì)胞參與炎癥性腸病的發(fā)病及其機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

3 朱苑露;海洋生物天然活性成分與細(xì)胞的相互作用研究[D];大連海洋大學(xué);2016年

4 張麗杰;北青龍衣細(xì)胞毒活性部位譜效關(guān)系的研究[D];黑龍江大學(xué);2011年

5 郭春雨;夾竹桃葉中的甾體類化學(xué)成分及其細(xì)胞毒活性的研究[D];華東理工大學(xué);2010年

6 張慧;高分子修飾抗腫瘤藥物的制備及細(xì)胞毒活性研究[D];西北師范大學(xué);2005年

7 劉萍;靈菌紅素Uncedylprodigiosin抗腫瘤活性機(jī)制研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

8 姚琳;神經(jīng)酰胺類似物的合成及其細(xì)胞毒活性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

9 劉海濱;紅樹林真菌草酸青霉Penicillium oxalicum細(xì)胞毒活性成分的研究[D];沈陽(yáng)藥科大學(xué);2007年

10 楊利瓊;倍半萜和甾體氮芥衍生物的合成及細(xì)胞毒活性研究[D];蘭州大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：284220