本文關(guān)鍵詞：腺苷A1受體介導(dǎo)的PI通路在酒精性肝纖維化大鼠星狀細(xì)胞模型中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：酒精性肝病是一種由于長(zhǎng)期大量飲酒所導(dǎo)致的肝臟類疾病。其疾病譜較廣,從脂肪肝到肝硬化甚至肝癌,而酒精性肝纖維化是這個(gè)過(guò)程中重要的一環(huán)。如何預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)酒精性肝纖維化的發(fā)生已愈來(lái)愈受到關(guān)注。在酒精性肝纖維化發(fā)生過(guò)程中,酒精在肝臟中的代謝物乙醛可激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC),HSC的活化會(huì)刺激產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。因此,HSC的活化增殖是酒精性肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。隨著對(duì)腺苷及其受體研究的逐步深入,人們認(rèn)識(shí)到腺苷受體(adenosine receptor,AR)在肝臟疾病中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究表明咖啡因作為非選擇性AR拮抗劑不僅能顯著抑制大鼠酒精性肝纖維化模型中肝纖維化的發(fā)生,同時(shí)內(nèi)外研究表明還能顯著抑制乙醛誘導(dǎo)的HSC活化。前期研究還顯示A1R和A2AR拮抗劑均可抑制酒精性肝纖維化中HSC的活化增殖但二者對(duì)c AMP-PKA-CREB通路有相反的調(diào)節(jié)作用,其中A2AR所介導(dǎo)的c AMP-PKA-CREB通路作用占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。目前認(rèn)為,在酒精依賴形成過(guò)程中,由G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的c AMP信號(hào)通路和磷脂酰肌醇(PI)信號(hào)通路是介導(dǎo)酒精效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)主要靶點(diǎn),其中PI通路的關(guān)鍵信號(hào)分子DAG和PKC也均是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的重要環(huán)節(jié)。所以,我們推測(cè)腺苷A1受體在酒精性肝纖維化中可能通過(guò)介導(dǎo)PI通路來(lái)調(diào)控HSC的活化增殖且與c AMP信號(hào)通路有信號(hào)交聯(lián)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè),本研究采用乙醛刺激HSC-T6細(xì)胞建立酒精性肝纖維化HSC模型,在此基礎(chǔ)上觀察腺苷A1受體介導(dǎo)的PI通路在調(diào)控HSC活化增殖中的作用以及與c AMP-PKA信號(hào)通路的交聯(lián)作用。研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)部分:1.A1R在酒精性肝纖維化細(xì)胞模型中表達(dá)增加我們首先通過(guò)乙醛(200μM)刺激HSC-T6 48h建立酒精性肝纖維化模型,檢測(cè)其A1R的表達(dá)。Real Time PCR及Western blot結(jié)果顯示:正常組及肝纖維化模型組中均有A1R表達(dá)且模型組中A1R m RNA和蛋白水平顯著高于正常組。2.si RNA沉默A1R對(duì)HSC活化增殖的影響實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、A1R si RNA組和陰性對(duì)照組。根據(jù)A1R基因序列設(shè)計(jì)并合成si RNA,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染進(jìn)HSC中。MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組HSC活力顯著下降,表明沉默A1R可顯著抑制已活化的HSC活力。進(jìn)一步采用Real Time PCR檢測(cè)α-SMA和Collagen I m RNA的表達(dá),Western blot法檢測(cè)α-SMA和Collagen I蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組α-SMA、Collagen I m RNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低,而陰性對(duì)照組表達(dá)無(wú)顯著差異,這表明靶向封閉A1R基因的表達(dá)可明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的活化增殖。3.AR介導(dǎo)的PI信號(hào)通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC中的作用實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、UTP組(IP3的前體物質(zhì),介導(dǎo)Ca2+釋放)、非選擇性AR激動(dòng)劑NECA組和UTP+NECA組。除正常組外,其余各組用乙醛(200μM)作用24h以制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。UTP組給予UTP(100μM)處理24h,NECA組給予NECA(10μM)處理24小時(shí),UTP+NECA組同時(shí)給予UTP(100μM)和NECA(10μM)處理24小時(shí)。采用ELISA法檢測(cè)各組HSC內(nèi)IP3的含量,Western blot法檢測(cè)各組HSC內(nèi)PLC蛋白的表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組HSC胞內(nèi)Ca2+的表達(dá)。結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組IP3含量、其信號(hào)中關(guān)鍵信號(hào)分子PLC蛋白表達(dá)及胞內(nèi)Ca2+的表達(dá)明顯升高,同時(shí)UTP組與NECA組結(jié)果較模型組顯著升高,且UTP預(yù)處理顯著增強(qiáng)NECA的效應(yīng)。結(jié)果提示,在HSC存在PI信號(hào)通路。隨后進(jìn)一步用Real Time PCR檢測(cè)α-SMA和Collagen I m RNA的表達(dá),Western blot檢測(cè)α-SMA和Collagen I蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UTP組、NECA組和UTP+NECA組α-SMA、Collagen I m RNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高,且UTP預(yù)處理顯著增強(qiáng)NECA的效應(yīng)。這表明AR介導(dǎo)的PI通路在HSC細(xì)胞的活化增殖中有調(diào)節(jié)作用。4.A1R介導(dǎo)的PI通路在A1R拮抗劑抑制HSC活化增殖中的作用在前期研究中已發(fā)現(xiàn)A1R拮抗劑抑制HSC活化增殖的基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步闡明A1R介導(dǎo)的PI通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中的作用,實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、A1R激動(dòng)劑CPA、A1R拮抗劑DPCPX組和CPA+DPCPX組。除正常組外,其余各組用乙醛(200μM)作用24h以制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。CPA組給予CPA(1μM)處理24h,DPCPX組給予DPCPX(10n M)處理24h,CPA+DPCPX組同時(shí)給予CPA(1μM)和DPCPX(10n M)處理24小時(shí)。采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組HSC內(nèi)Ca2+的表達(dá),ELISA法檢測(cè)各組HSC內(nèi)IP3、DAG的含量,Western blot法檢測(cè)各組HSC內(nèi)PLC、PKC蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,經(jīng)CPA處理后,模型組HSC中胞內(nèi)Ca2+的表達(dá),IP3、DAG含量及PLC、PKC蛋白表達(dá)上升。而DPCPX作用后HSC中胞內(nèi)Ca2+的表達(dá),IP3、DAG含量及PLC、PKC蛋白表達(dá)下降。同時(shí),與單獨(dú)用藥組比較,CPA+DPCPX聯(lián)合用藥組上述作用均可逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明A1R調(diào)控的PI通路在乙醛誘導(dǎo)的HSC活化增殖中具有一定作用。5.PLC-PKC信號(hào)通路與c AMP-PKA信號(hào)通路的信號(hào)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、PKC激動(dòng)劑PMA組、PKC抑制劑SC-3088組共同孵育大鼠HSC,比較不同組別HSC活化增殖情況,采用Elisa法檢測(cè)各組HSC內(nèi)c AMP的含量,Western blot法檢測(cè)各組HSC內(nèi)PKA蛋白的表達(dá)。考察PKC活性的升高或降低對(duì)c AMP含量和PKA活性的影響。結(jié)果顯示PMA組α-SMA、Collagen I的表達(dá)、c AMP的含量和PKA蛋白的表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng),而經(jīng)SC-3088處理后顯著下降。再將實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、PKA激動(dòng)劑FSK組、PKA抑制劑H89組共同孵育大鼠HSC,比較不同組別HSC活化增殖情況,Western blot法檢測(cè)各組HSC內(nèi)PLC、PKC蛋白的表達(dá)�？疾霵KA活性的升高或降低對(duì)PLC、PKC活性的影響。結(jié)果顯示FSK組α-SMA、Collagen I的表達(dá)、PLC、PKC蛋白的表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng),而經(jīng)H89處理后顯著下降。闡明PLC-PKC信號(hào)通路與cAMP-PKA信號(hào)通路互為正向調(diào)節(jié)。綜上所述,在大鼠酒精肝纖維化HSC模型中,A1R表達(dá)較正常HSC增強(qiáng)。沉默A1R基因的表達(dá)可明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的活化增殖,A1R調(diào)控的PI通路在乙醛誘導(dǎo)的HSC活化增殖中具有一定作用且與c AMP-PKA信號(hào)通路有交聯(lián)作用。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 乙醛 肝星狀細(xì)胞 腺苷 腺苷受體 信號(hào)交聯(lián)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照6-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-16
• 1.前言16-17
• 2.實(shí)驗(yàn)材料17-22
• 2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株17
• 2.2 主要試劑17-19
• 2.3 儀器與設(shè)備19
• 2.4 溶液和試劑的配制19-21
• 2.5 引物基因序列21
• 2.6 圖像分析軟件21-22
• 3.實(shí)驗(yàn)方法22-29
• 3.1 HSC細(xì)胞培養(yǎng)及傳代22
• 3.2 大鼠酒精性肝纖維化HSC模型的建立22
• 3.3 A1R-si RNA轉(zhuǎn)染HSC22-23
• 3.4 MTT試驗(yàn)23
• 3.5 ELISA法檢測(cè)c AMP、DAG、IP3含量23-24
• 3.6 激光共聚焦檢測(cè)胞外刺激下Ca2+內(nèi)流變化24
• 3.7 細(xì)胞總RNA的提取24-25
• 3.8 Real Time PCR25-26
• 3.9 Western Blot26-28
• 3.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析28-29
• 4.結(jié)果29-47
• 4.1 腺苷A1受體在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中的表達(dá)情況29-30
• 4.2 轉(zhuǎn)染沉默腺苷A1受體對(duì)乙醛誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化增殖的影響30-32
• 4.3 腺苷受體介導(dǎo)的PI信號(hào)通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC中的作用32-36
• 4.4 腺苷A1受體調(diào)節(jié)劑對(duì)大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中PI信號(hào)通路的影響36-42
• 4.5 PLC-PKC信 號(hào)通路與c AMP-PKA信 號(hào)通路的交聯(lián)作用42-47
• 5.討論47-51
• 6.結(jié)論51
• 參考文獻(xiàn)51-58
• 附錄58-60
• 致謝60-61
• 綜述61-71
• 參考文獻(xiàn)66-71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 陳蓮香;舒建昌;;PDGF與肝纖維化關(guān)系的研究新進(jìn)展[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2011年01期

2 黃艷;黃成;李俊;;肝纖維化病程中Kupffer細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)肝星狀細(xì)胞活化增殖、凋亡的調(diào)控[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2010年01期

3 代雪飛;呂雄文;管文婕;楊萬(wàn)枝;李俊;;咖啡因?qū)σ胰┐碳さ拇笫蟾涡菭罴?xì)胞HSC-T6增殖、凋亡的影響及部分作用機(jī)制[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年08期

  本文關(guān)鍵詞：腺苷A1受體介導(dǎo)的PI通路在酒精性肝纖維化大鼠星狀細(xì)胞模型中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：266816