本文關(guān)鍵詞：糖胺聚糖活性適體制備及其應(yīng)用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：糖胺聚糖,也稱(chēng)酸性粘多糖,是由重復(fù)的二糖單位構(gòu)成的,其二糖單位之一是氨基己糖。肝素是一種具有抗凝血活性的糖胺聚糖,是世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物,其原料主要來(lái)源于豬的小腸粘膜,目前,肝素臨床用藥主要采用注射給藥方式,對(duì)肝素原料的純度要求較高,方可保證制劑的用藥安全,因此,如何研究綠色環(huán)保、成本低廉的肝素純化新技術(shù)成為肝素制劑的關(guān)鍵問(wèn)題。SELEX技術(shù)即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù),是從體外人工合成的寡核苷酸文庫(kù)中篩選獲得與靶分子特異性親和的一段寡核苷酸序列。本課題研究通過(guò)體外合成一個(gè)具有25個(gè)隨機(jī)堿基的寡核苷酸序列庫(kù),采用SELEX技術(shù),從中篩選能與肝素特異性親和作用的核酸序列,將篩選得到的DNA序列進(jìn)行克隆、測(cè)序,通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,測(cè)定克隆子與肝素的親和力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)25輪篩選,共得到20個(gè)克隆子,獲得3個(gè)高頻適配子。軟件分析預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)為莖環(huán)狀結(jié)構(gòu),說(shuō)明莖環(huán)結(jié)構(gòu)是適配體與靶分子結(jié)合的基礎(chǔ)。對(duì)3條序列建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果表明,H29與肝素結(jié)合的親和力達(dá)到0.528,親和性較高。肝素特異性適體的獲得為今后解決肝素制藥難點(diǎn)提供了新思路,新工藝。
【關(guān)鍵詞】：肝素 適配子 SELEX ELISA
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R943
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-6
• 縮略詞一覽表6-9
• 第一章 緒論9-18
• 1.1 核酸適配子SELEX篩選研究進(jìn)展9-14
• 1.1.1 SELEX技術(shù)簡(jiǎn)介9
• 1.1.2 SELEX技術(shù)的改良9-10
• 1.1.3 針對(duì)不同靶標(biāo)的適配子的研究10-13
• 1.1.4 SELEX技術(shù)的優(yōu)越性及其應(yīng)用13-14
• 1.2 肝素的結(jié)構(gòu)和功能14-16
• 1.2.1 結(jié)構(gòu)特征14-15
• 1.2.2 在生物體內(nèi)的分布及其生理功能15
• 1.2.3 肝素的藥理作用15-16
• 1.3 肝素的研究現(xiàn)狀及趨勢(shì)16
• 1.4 研究目的、意義及研究?jī)?nèi)容16-18
• 1.4.1.研究目的16
• 1.4.2 研究意義16-17
• 1.4.3 研究?jī)?nèi)容17-18
• 第二章 瓊脂糖凝膠作為親和介質(zhì)SELEX篩選肝素適配子18-33
• 2.1 引言18
• 2.2 材料與方法18-20
• 2.2.1 質(zhì)粒與載體18
• 2.2.2 工具酶與主要試劑18-19
• 2.2.3 主要緩沖液與相關(guān)試劑及其配制19
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法20-24
• 2.3.1 初始隨機(jī)文庫(kù)的構(gòu)建及引物的合成20
• 2.3.2 Epoxy-activated SepHrose固定肝素20-21
• 2.3.3 SELEX篩選21
• 2.3.4 PCR擴(kuò)增21-22
• 2.3.5 瓊脂糖凝膠電泳22
• 2.3.6 次級(jí)文庫(kù)的制備22
• 2.3.7 DNA適配子的克隆測(cè)序及分析22-24
• 2.4 結(jié)果24-29
• 2.4.1 瓊脂糖凝膠鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物24
• 2.4.2 對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果24-25
• 2.4.3 尿素濃度在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的優(yōu)化結(jié)果25-26
• 2.4.4 13輪篩選的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果26
• 2.4.5 克隆子序列測(cè)定結(jié)果26-27
• 2.4.6 適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)分析27-29
• 2.5 討論29-31
• 2.5.1 文庫(kù)的選擇29-30
• 2.5.2 溫度對(duì)SELEX篩選的影響30
• 2.5.3 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)SELEX的影響30
• 2.5.4 ssDNA的制備方法30-31
• 2.5.5 適配子的克隆測(cè)序31
• 2.5.6 適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析31
• 2.6 本章小結(jié)31-33
• 第三章 以酶標(biāo)板作為親和介質(zhì)SELEX篩選肝素適配子33-38
• 3.1 引言33
• 3.2 材料和方法33-34
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品33
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器33-34
• 3.2.3 主要溶液的配制34
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)方法34
• 3.3 結(jié)果與討論34-36
• 3.3.1 12 輪篩選的 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果34-35
• 3.3.2 克隆子序列測(cè)定結(jié)果35
• 3.3.3 適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)35-36
• 3.3.4 適配子篩選固相分離介質(zhì)的選擇36
• 3.4 本章小結(jié)36-38
• 第四章 克隆適配子的親和力測(cè)定38-43
• 4.1 引言38
• 4.2 材料與方法38-39
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品38
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑38-39
• 4.2.3 主要溶液的配制39
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法39-41
• 4.3.1 對(duì)稱(chēng) PCR39
• 4.3.2 不對(duì)稱(chēng)PCR39-40
• 4.3.3 瓊脂糖凝膠電泳及切膠40
• 4.3.4 凝膠中回收ssDNA40
• 4.3.5 ELISA法檢測(cè)克隆子與肝素鈉的親和力40-41
• 4.4 結(jié)果和討論41-42
• 4.5 本章小結(jié)42-43
• 第五章 總結(jié)與展望43-44
• 5.1 總結(jié)43
• 5.2 展望43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 致謝49

【相似文獻(xiàn)】

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