本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行心臟毒性評價(jià)方法的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的藥物引發(fā)的心臟毒性一直是藥物研發(fā)人員以及各國藥監(jiān)部門關(guān)注的重點(diǎn)。人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議(ICH)、FDA、CFDA等相繼頒布了多項(xiàng)規(guī)定和條例來加強(qiáng)藥物的心臟毒性評價(jià)研究�，F(xiàn)有的心臟毒性評價(jià)缺乏有效、合理的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?建立準(zhǔn)確可靠的方法評價(jià)藥物的心臟毒性在藥物早期研發(fā)階段具有重要的意義,是當(dāng)前藥物安全性評價(jià)及毒理學(xué)研究亟需解決的問題。近年來,有關(guān)人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞(Human Embryonic Stem Cell-derived Cardiomyocytes,h ESC-CM)的研究日益增多,研究指出其可成為一種用于評價(jià)藥物心臟毒性的新型模型。因此我們選用幾種不同毒性機(jī)制的陽性藥物研究h ESC-CM心臟毒性評價(jià)方法,從細(xì)胞的功能和電生理變化兩個(gè)方面綜合評價(jià)藥物的心臟毒性,并應(yīng)用細(xì)胞功能評價(jià)方法評價(jià)化合物A的心臟毒性。研究方法與結(jié)果1.應(yīng)用人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞功能評價(jià)的研究本研究選用不同種類的心臟毒性藥物:阿霉素(蒽環(huán)類抗腫瘤藥,Doxorubicin,DOX)、伊馬替尼(酪氨酸激酶抑制劑,Imatinib,IMA)、異丙腎上腺素(β受體激動劑,Isoproterenol,ISO)、維拉帕米(鈣離子通道阻滯劑,Verapamil,VER),分別與成熟分化、狀態(tài)穩(wěn)定的h ESC-CM孵育,采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法和高內(nèi)涵熒光成像技術(shù)檢測心肌細(xì)胞搏動的振幅、頻率、規(guī)則性及線粒體膜電位等指標(biāo)在給藥1 h、4 h、24 h、48 h、72 h、96 h后的變化,建立人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞心臟細(xì)胞功能毒性評價(jià)方法。在以上研究基礎(chǔ)上,應(yīng)用此方法評價(jià)化合物A的心臟毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:①各濃度組的阿霉素作用于h ESC-CM時(shí),細(xì)胞的搏動振幅、搏動頻率、搏動規(guī)則指數(shù)、線粒體膜電位均降低,對心肌細(xì)胞具有明顯的毒性作用;②20μmol·L-1的伊馬替尼抑制細(xì)胞的搏動振幅、搏動頻率、搏動規(guī)則指數(shù)、線粒體膜電位,說明高濃度的伊馬替尼毒性作用明顯;③異丙腎上腺素使h ESC-CM的搏動振幅降低、搏動頻率升高,但此作用具可逆性,藥物的濃度越小可逆性越強(qiáng),異丙腎上腺素對細(xì)胞的搏動規(guī)則指數(shù)、線粒體膜電位無明顯影響;④維拉帕米使h ESC-CM的搏動振幅、搏動頻率迅速降低,該作用在藥物低濃度時(shí)可得到緩解,細(xì)胞的搏動規(guī)則指數(shù)、線粒體膜電位均無明顯變化。在方法的應(yīng)用階段,化合物A和其陽性對照藥托法替布對h ESC-CM的影響一致:對搏動振幅的抑制作用成濃度時(shí)間相關(guān)性;對搏動頻率、搏動頻率規(guī)則指數(shù)也有一定的抑制作用;對線粒體膜電位的影響不顯著。2.應(yīng)用人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行心臟電生理功能評價(jià)的研究研究選用DOX、IMA、ISO、VER分別與h ESC-CM孵育,應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞動作電位、h ERG鉀電流、Nav1.5電流、以及L-Ca2+電流在給藥前后的變化,建立人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞心臟電生理功能評價(jià)模型。結(jié)果顯示:①DOX對h ESC-CM動作電位時(shí)程(Action Potential Duration,APD)有輕微的縮短作用,減小動作電位振幅(Action Potential Amplitude,APA)、降低靜息電位(Resting Potential,RP),以上作用隨DOX濃度的增加而增強(qiáng);DOX對動作電位0相除極速率(Max dv/dt)、Nav1.5電流、L-Ca2+電流及h ERG電流無明顯作用;②IMA對h ESC-CM的Nav1.5電流有強(qiáng)烈的抑制作用,IC50低至2.00±0.49μmol·L-1;對L-Ca2+電流具有抑制作用,IC50為23.4±9.8μmol·L-1;對h ERG電流無明顯作用;細(xì)胞的APA、APD50、APD90隨IMA濃度增加而縮短,提示IMA可縮短細(xì)胞動作電位時(shí)程,分析該作用可能與它對Nav1.5、L-Ca2+的抑制作用有關(guān);③ISO對h ESC-CM的Nav1.5電流抑制作用較小,IC50大于100μmol·L-1;但對L-Ca2+電流具有激活作用,可增強(qiáng)L-Ca2+電流,除此之外,ISO還可抑制h ERG電流;ISO對細(xì)胞的動作電位無明顯作用;④VER對Nav1.5電流有抑制作用,IC50為47.3±5.4μmol·L-1;對L-Ca2+電流有強(qiáng)烈的抑制作用,使其迅速降低,IC50為7.1±1.5μmol·L-1;對h ERG電流有明顯的抑制作用,IC50為3.5±1.0μmol·L-1;APD50、APD90、APA、RP以及動作電位Max dv/d隨VER濃度的增加而受到VER的抑制;以上結(jié)果提示VER具有多離子通道抑制作用,明顯影響h ESC-CM的電生理功能。結(jié)論本研究分別建立了應(yīng)用人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞功能和電生理功能評價(jià)的方法。應(yīng)用結(jié)合實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法以及高內(nèi)涵細(xì)胞成像技術(shù)建立的心臟細(xì)胞功能評價(jià)方法成功評價(jià)了新化合物的心臟毒性。結(jié)果說明人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞可作為一種新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?用于評價(jià)藥物的心臟毒性。
【關(guān)鍵詞】：人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞 心臟毒性 安全性評價(jià) 細(xì)胞功能 電生理 hERG 離子通道
【學(xué)位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：260839