本文關(guān)鍵詞：中藥配伍禁忌藥理學(xué)及藥學(xué)研究現(xiàn)狀，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《安徽醫(yī)科大學(xué)》 2012年

PXR受體激動劑高通量篩選模型的優(yōu)化和天然活性成分的篩選

劉浩生  

【摘要】：目的：利用本實驗室前期構(gòu)建完成的PXR-CYP3A穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2工程細胞株對中藥單體成分進行高通量篩選，希望找到對PXR有激活作用的單體成分。首先對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的穩(wěn)定性和細胞培養(yǎng)的基本條件進行了優(yōu)化，隨后對“諸參辛芍叛藜蘆”的各單味藥水煎液和部分單體成分對該工程細胞株CYP3A4的誘導(dǎo)情況進行檢測，考察30種單體成分的PXR激活及CYP3A誘導(dǎo)能力，試圖從CYP3A角度解釋“諸參辛芍叛藜蘆”相反作用機制；接著對本實驗保存的118種中藥單體進行了PXR激活及CYP3A誘導(dǎo)情況篩選，最后對篩選所得誘導(dǎo)作用較強的單體成分五味子甲素用于石膽酸引起的肝損傷的保護作用進行了整體動物實驗研究。 方法：利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染工程細胞株作為篩選模型并結(jié)合報告基因技術(shù)對天然產(chǎn)物水提物和118種單體成分進行PXR激活特性高通量篩選；利用過量石膽酸造成小鼠肝臟損傷的模型，考察了五味子甲素對PXR調(diào)控膽汁酸代謝相關(guān)靶基因表達影響及肝臟損傷的保護作用進行了考察。 結(jié)果：通過條件優(yōu)化得到的最佳篩選條件是：細胞鋪板密度為10×104，血清使用活性炭吸附胎牛血清（FBS），藥物最佳處理時間為48h，利福平（RIF）有效刺激濃度為5μM；同時在對細胞篩選的穩(wěn)定性和細胞生長環(huán)境變化對篩選信號強度的影響進行了考察：通常情況下由于藥物加入導(dǎo)致細胞培養(yǎng)液pH值改變未對Gaussia熒光素酶穩(wěn)定性產(chǎn)生明顯影響，但是細胞生長會受到抑制；同時在高濃度DMSO條件下，細胞狀態(tài)和熒光素酶分泌均保持穩(wěn)定。利用該細胞篩選模型結(jié)合優(yōu)化的條件，對“諸參辛芍叛藜蘆”中各單味藥水煎液和單體成分激活PXR和誘導(dǎo)CYP3A4進行了篩選：結(jié)果顯示人參水提物濃度在大于50mg/ml、北沙參和白芍水提物在5~100mg/ml條件下與MEM組比較都對報告基因信號具有抑制作用；而人參水提物在濃度為小于25mg/ml、南沙參水提物在濃度為50mg/ml、細辛水提物在濃度為10mg/ml的時候表現(xiàn)出較強激活效應(yīng)。藜蘆1.25mg/ml是細胞最適培養(yǎng)濃度，通過觀察細胞生長情況，發(fā)現(xiàn)藜蘆組細胞生長緩慢，有細胞大量死亡情況出現(xiàn)，顯示出較強的細胞毒作用。在對各單味藥水提物篩選有明顯的激活效應(yīng)或抑制效應(yīng)的基礎(chǔ)上，對各單味藥所含的一些單體成分進行了篩選，希望找到水提物中真正起作用的單體成分，利用本實驗室保存的人參、黨參、丹參等的主要成分標準品進行篩選，結(jié)果顯示人參的主要皂苷類成分熒光素酶報告基因的誘導(dǎo)倍數(shù)均低于RIF處理組，其中人參三醇、人參皂苷Rf、20(S)-人參皂苷Rg2、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb有潛在的拮抗PXR抑制CYP3A特性。20(S)-原人參三醇，20(S)-人參皂苷F2呈現(xiàn)PXR激活特性，其誘導(dǎo)倍數(shù)高于DMSO組。芝麻素、丹參素鈉、原兒茶酸的誘導(dǎo)倍數(shù)低于DMSO，丹參酮IIA（24h）、丹參酮IIA磺酸鈉（48h）、熊果酸（24h，48h）誘導(dǎo)能力強于DMSO，顯示出中等強度的PXR激活效應(yīng)。對本實驗保存的其他118種中藥單體進行了高通量篩選，其中蘿巴新、百秋李醇、五味子甲素等化合物能不同程度地激活PXR，具有潛在的酶誘導(dǎo)效應(yīng)；化合物黃芩苷、人參皂苷Rg1、氧化苦參堿、人參皂苷Rb等化合物在10μM條件下不同程度抑制PXR活性。整體動物實驗的結(jié)果顯示，五味子甲素各劑量組能有效逆轉(zhuǎn)LCA所致肝損傷小鼠外周血ALT及AST的升高，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，小鼠在給予五味子甲素后，肝細胞的壞死程度得到明顯改善，而五味子甲素對LCA所致小鼠肝損傷的保護作用可能與其調(diào)控LCA合成及代謝的關(guān)鍵基因SHP，CYP7A1及CYP3A11的表達有關(guān)。結(jié)論：通過基于PXR-CYP3A通路的細胞篩選實驗，發(fā)現(xiàn)中藥方劑配伍規(guī)律和配伍禁忌可能與其所含其單體成分對藥物代謝酶CYP3A4誘導(dǎo)或抑制密切相關(guān)：人參配伍藜蘆相反主要是由于在配伍合用時，，隨著人參用藥濃度的增加，人參皂苷類成分溶出增多，而皂苷類成分主要呈拮抗PXR抑制CYP3A表達的能力，其結(jié)果是導(dǎo)致機體對藜蘆主要毒性成分藜蘆定堿、介芬胺等生物堿的代謝受到抑制。在四物湯中白芍的“反佐作用”也可能與白芍能抑制CYP3A表達相關(guān)。通過對單體成分的篩選實驗發(fā)現(xiàn)了一系列具有潛在誘導(dǎo)或抑制能力的化合物，對深入研究誘導(dǎo)或抑制CYP3A的藥理學(xué)意義，發(fā)現(xiàn)可能的藥物相互作用和治療肝臟相關(guān)疾病的化合物提供了很好的線索。利用過量石膽酸造成的肝損傷模型對篩選得到天然產(chǎn)物五味子甲素對小鼠CYP3A誘導(dǎo)能力與加速膽汁酸代謝和保護肝臟作用進行了初步探索，為尋找膽汁酸淤積造成的肝損傷相關(guān)藥物研究提供了很好的工作基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R285.5
【目錄】：

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本文編號：147923