【摘要】 沙丁胺醇為一種β2受體激動劑，能選擇性激動支氣管平滑肌的β2受體，有強大而迅速的支氣管擴張作用。左旋硫酸沙丁胺醇是從消旋硫酸沙丁胺醇拆分得到的高光學純的化合物，與消旋體相比有高效低毒的特點。肺部吸入以其獨特的優(yōu)勢成為治療呼吸系統(tǒng)疾病理想的給藥途徑。本文主要研究硫酸沙丁胺醇、左旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液，并對其進行質(zhì)量研究和藥效評價，研究內(nèi)容如下：(1)擬定了消旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液的配方，按照中國藥典藥品質(zhì)量標準要求，對其進行了詳細的質(zhì)量研究，并對試制的三批樣品進行了包括影響因素試驗、加速試驗和長期試驗在內(nèi)的穩(wěn)定性考察。在此基礎(chǔ)上，對左旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液進行了同樣的研究。其研究結(jié)果為擬定左旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液的質(zhì)量標準提供必要依據(jù)。(2)參考歐洲藥典(EP7.3)和美國藥典對吸入制劑指標的評價要求，分別使用新一代藥用多級撞擊器和呼吸模擬裝置分析了自制制劑與市售制劑的粒徑分布情況和劑量遞送均一性，利用高效液相色譜法進行定量。結(jié)果顯示：自制左旋和消旋霧化吸入溶液的FPF%(可吸入顆粒百分數(shù))分別高達72.81%和71.97%，與萬托林（71.96%）和達芬科闖（71.78%）相比無顯著性差異，且MMAD（μm，質(zhì)量中位直徑）的大小也無顯著性差異，依次為3.278、3.321、3.390、3.406；劑量遞送均一性測試結(jié)果顯示自制制劑與市售的萬托林、達芬科闖在劑量遞送速率和總的藥物遞送量方面具有可以性。上述對制劑進行的體外分析結(jié)果支持了自制制劑的配方合理性和質(zhì)量可靠性。(3)利用組胺刺激豚鼠誘發(fā)氣道高反應(yīng)性，建立了哮喘急性發(fā)作模型，通過給予低、中、高梯度藥物劑量給藥觀察左旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入的藥效發(fā)揮程度，統(tǒng)計分析顯示：依次吸入低、中、高劑量的藥液后，分別給予給予15ug/ml,0.5ml同等程度組胺刺激，豚鼠氣道阻力上升率依次為102.67%、55.23%、25.53%，與空白組胺刺激的氣道阻力上升值425.37%相比有極顯著差異，動態(tài)肺順應(yīng)性的變化率也從空白組的-83.85%分別上升為-62.24%、-48.82%和25.18%。與加倍劑量給藥的消旋硫酸沙丁胺醇對肺功能的改善作用相比無顯著差異，有力的支撐了進行左旋硫酸沙丁胺醇研究和開發(fā)的合理性與重要意義。 

第一章 緒論

1.1 哮喘現(xiàn)狀概述
1.1.1 國內(nèi)外患病形勢
在過去的五十年里，西方國家患哮喘及相關(guān)過敏性疾病的人群增加顯著，這主要歸咎于城市化和不斷改變的飲食以及生活方式[1]，同時哮喘疾病的流行性、發(fā)病率和死亡率也是逐年增加[2,3]，在我國哮喘患病率也呈逐年上升趨勢，成人發(fā)病率為 0.7%~1.5%，兒童為 0.11%~2.03%。全國約有 2000 萬患者之多[4]。盡管存在不同國家、地區(qū)和人群間的差異，但可以肯定的是哮喘有愈發(fā)嚴重的趨勢。在 2000 年由全國兒科哮喘協(xié)作組和香港中文大學共同完成的一項面向全國兒童哮喘情況調(diào)查的結(jié)果顯示，我國的哮喘患病率明顯上升（統(tǒng)計學有顯著意義），從 1990 年的 0.9%[5]上升到了 2000 年的 1.5%[6]，十年之內(nèi)增加了 64.8%，與全球范圍內(nèi)哮喘患病率普遍升高的趨勢是一致的。
在今年由首都兒科研究所、北京大學第一醫(yī)院、過敏與哮喘醫(yī)患聯(lián)盟（中國）舉辦的“世界哮喘日”宣傳教育活動中，世界衛(wèi)生組織全球哮喘防治創(chuàng)議顧問及推廣委員會委員、首都兒科研究所哮喘防治教育中心陳育智教授透露了這樣一個事實：2000 年~2010年，我國 0-14 歲兒童的哮喘患病率上升了 50%左右！這印證了很多兒科醫(yī)生的主觀感受—哮喘患兒在逐年增加。幾十年來哮喘在我國發(fā)病率在逐漸上升，陳育智教授對此深有體會，她曾主持 3 次全國兒童哮喘的流行病學調(diào)查工作：在 1990 年，我國 0-14 歲兒童的哮喘平均患病率為 1.08%；2000 年，這個數(shù)字增加到 1.97%；而 2010 年第三次全國兒童哮喘兒童流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，兒童哮喘患病率達到了 3.01%，在 2000 年的基礎(chǔ)上上升了 50%左右。而在歐美形勢也不容樂觀，根據(jù)美國疾病防控中心的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在美國每 11 個兒童中就有 1 個患有哮喘；此外，每 5 個兒童中就有 1 個因為哮喘發(fā)作必須就診于急救中心，每年政府需要花費數(shù)十億美元用于兒童哮喘發(fā)病住院就醫(yī)[7,8]。因此有國外專家預測，到 2020 年，哮喘疾病會成為世界第三大殺手。
1.1.2 哮喘發(fā)病機理
哮喘目前可以說是世界性難題，不僅發(fā)病機制未完全清楚，同時確診為哮喘的患者在治療上也有諸多困難。鑒于哮喘發(fā)病機制的復雜性，目前還沒有哪種學說或者解釋可以完全闡明其整個發(fā)病機理，但有很多學者從不同方面做了研究，并取得了不錯的進展。氣道炎癥機制側(cè)重的是哮喘發(fā)病中各種炎癥細胞扮演的角色，不同類型的細胞會釋放多種介質(zhì)和細胞因子如血小板活化因子、白三烯、前列腺素等介質(zhì)以及 IL-4、IL-9、IL-13等細胞因子，這些物質(zhì)在變應(yīng)原刺激機體后，大量釋放使機體細胞出于“致敏狀態(tài)”，當變應(yīng)原再次接觸機體，這些物質(zhì)就會引起氣道平滑肌痙攣、血管通透性增加，氣道粘膜水腫充血，筆耕文化傳播，最終誘發(fā)氣道高反應(yīng)性[9]。呼吸道上皮細胞是炎癥發(fā)生、免疫反應(yīng)的重要場所，它影響著哮喘病變中機體對外界變應(yīng)原、病毒和環(huán)境污染物的響應(yīng)。它可表達對環(huán)境刺激因子起監(jiān)測作用的受體以及分泌內(nèi)源性危險信號，這兩者激活樹突細胞并使先天免疫和獲得性免疫功能發(fā)揮作用。對上皮細胞功能的深入理解有助于更好地了解哮喘發(fā)生和惡化的機理[10]。而對于病毒感染和過敏性疾�。ū热邕^敏性鼻炎和皮炎）在哮喘發(fā)生和發(fā)展過程中所扮演的重要角色，也使人們對哮喘的發(fā)病機理和治療手段有了進一步的認識[11]。上述研究結(jié)果足以證明哮喘發(fā)病機理的復雜性和交錯性，同時也給哮喘治療帶來了更大的挑戰(zhàn)。但眾多專家們對于哮喘發(fā)病機理的不斷深入研究和得出的肯定性結(jié)論有助于醫(yī)藥從業(yè)人員更好的理解這種疾病，并提出針對性的治療方案。
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1.2 哮喘的控制和治療
1.2.1 臨床治療方案
哮喘作為一種慢性疾病，兒童在初期如不及時治療很容易發(fā)展為成人哮喘而危害終身，因此早期診斷、早期治療對于控制哮喘非常關(guān)鍵。目前來說臨床中已采用了多種方法用于治療哮喘，對于不同發(fā)病時期和癥狀的患者，哮喘的治療應(yīng)各有不同，有的采用聯(lián)合用藥，比如糖皮質(zhì)激素類藥物布地奈德和硫酸沙丁胺醇聯(lián)合用藥治療[12]以及異丙托溴銨聯(lián)合硫酸沙丁胺醇給藥霧化吸入[13]；有的采用單獨給藥[14]。治療手段既有基于控制目的需要長期每天使用的藥物如糖皮質(zhì)激素和長效 β2 受體激動劑福莫特羅、班布特羅以及沙美特羅等；也有按需使用的緩解藥物，這主要針對于病癥急性發(fā)作時迅速解除支氣管痙攣緩解哮喘癥狀，避免患者因呼吸困難而有生命危險，使用的有抗膽堿能藥物如異丙托溴銨、阿托品以及速效 β2受體激動劑如沙丁胺醇、特布他林等。
但事實是很多患者在發(fā)病早期，由于癥狀不顯著或是醫(yī)療水平所限被“誤診”而喪失了早期的最佳治療機會，最終發(fā)展為不可逆的成人哮喘。在 2010 第三次全國兒童哮喘兒童流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)有 30%的患兒在早期未明確診斷哮喘，且多數(shù)是在半歲~2 歲病毒感染后被診斷為“肺炎、支氣管炎”等感染性疾病治療，采用不恰當?shù)膽?yīng)用抗生素及短期解痙治療，未長期正規(guī)給予抗氣道炎癥或擔心吸入激素而喪失了早期治療的機會。因此對于哮喘的診斷和治療規(guī)范方法才能更好的控制該疾病的惡化和蔓延。
在過去幾十年中，在有關(guān)哮喘發(fā)病機制的研究和有效控制哮喘的治療方案方面都取得了巨大進展，在 1993 年,美國國立心肺血液研究所與世界衛(wèi)生組織合作起草了全球哮喘管理和預防策略的報告,同時推行全球哮喘防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma ，GINA), GINA 的目標包括：提高哮喘作為一個全球性的公共衛(wèi)生問題的認識；提供診斷和治療哮喘的關(guān)鍵性建議；為不同健康需求、不同的健康服務(wù)機構(gòu)和衛(wèi)生資源提供相應(yīng)的策略；為全球社會指明具有特殊意義的研究領(lǐng)域。
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第二章 消旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液質(zhì)量研究

2.1 引言
肺部的結(jié)構(gòu)不同于消化道，從肺部進入的顆粒（包括藥物和輔料）是較難被清除出體外的，因此通過肺部途徑進行的給藥所用的輔料要求越少越好，在保證藥效的前提下盡可能的不加或者少加其他的附加劑，即使必須要用也應(yīng)是可以被人體代謝的，同時盡可能通過制劑的手段減少輔料進入支氣管以下的部位，以免影響肺的正常生理功能。已有研究表明為控制微生物限度添加有苯扎氯銨的吸入溶液會導致哮喘患者產(chǎn)生支氣管痙攣，概率約為 3%[83]。
消旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液在國內(nèi)已有上市，自國內(nèi)有廠家申報開始，國家藥監(jiān)局已先后幾次頒發(fā)文件對該劑型的質(zhì)量標準不斷進行提高，隨著科技的發(fā)展和技術(shù)的日益成熟，其質(zhì)量標準更加規(guī)范，力求更加系統(tǒng)和全面的評價該制劑，但現(xiàn)行的最新版中國藥典(2010 版)中暫時未將該制劑的質(zhì)量標準納入其中。目前最新的質(zhì)量標準是 2012年 3 月國家食品藥品監(jiān)督管理局下發(fā)的十八種藥品標準修訂件中提出的，較早前頒布的標準相比，修訂了含量測定的濃度，增加了有關(guān)物質(zhì)檢測的要求，并提出了色譜條件以及系統(tǒng)適用性的概念。本次頒布的標準中有關(guān)物質(zhì)和含量測定色譜條件均與歐洲藥典5.5 版以及英國 2010 版中硫酸沙丁胺醇的質(zhì)量規(guī)范具有很高的同一性，說明國家藥監(jiān)局在逐漸的提高國內(nèi)的藥品標準并向國際標準看齊。該質(zhì)量標準對霧化溶液的各個控制要求做了明確的規(guī)定，本研究中常州亞邦制藥公司生產(chǎn)的符合中國藥典標準的消旋硫酸沙丁胺醇原料藥，作為臨床前研究的小試生產(chǎn)以及考慮到現(xiàn)有的實驗室研究條件，本研究中重點控制的指標是有關(guān)物質(zhì)和含量測定。
目前國內(nèi)市售的消旋沙丁胺醇霧化吸入溶液（萬托林、達芬科闖）的規(guī)格均以 20 ml瓶裝規(guī)格為主，濃度為 5 mg/ml。因此在使用時一般需要經(jīng)過生理鹽水稀釋后方可霧化吸入。綜合肺部吸入給藥開發(fā)的安全性以及患者使用時的方便性、依從性。本實驗中選擇的溶劑體系為不含苯扎溴銨等防腐劑的溶液，配置濃度選擇時考慮市售處方以及后續(xù)進一步的左旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液的研究最終擬訂為 2.5 mg/ml，同時硫酸沙丁胺醇制備為水溶液后的穩(wěn)定性也是控制制劑質(zhì)量的重要因素，霧化吸入溶液的制備必須保證藥物粒子在水溶液中有良好的物理和化學穩(wěn)定性。早在 1990 年就有學者對硫酸沙丁胺醇的水溶液穩(wěn)定性進行了詳細的研究，其結(jié)果表明在 pH 為 3.5 時，硫酸沙丁胺醇有最大的穩(wěn)定性[84]。因此本研究中最終擬定的配方為：無色或幾乎無色的澄清透明等滲溶液，規(guī)格為 2.5mg/ml(10 ml)，pH 范圍為 3.0～5.0。
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2.2 材料與方法
2.2.1 實驗儀器與試劑
2.2.2 實驗方法
2.2.2.1 有關(guān)物質(zhì)檢測方法的研究與驗證
1、色譜條件
色譜儀：Shimadzu LC-10ATvp
色譜柱：Inertsil C8-3 (250×4.6 mm，5  m)
流動相：以庚烷磺酸鈉溶液[取庚烷磺酸鈉 2.87 g 與磷酸二氫鉀 2.5 g，加水溶解并稀釋至 1000 ml，用磷酸溶液（1→2）調(diào)節(jié) pH 值至 3.65]-乙腈（78:22）為流動相
檢測波長：220 nm
流速：1 ml/min
進樣量：20 μl
柱溫：室溫
2、方法學驗證
(1) 溶液的配制
取消旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液(2.5mg/ml，以下簡稱霧化溶液)適量，用流動相稀釋制成每 1 ml 中約含沙丁胺醇 2 mg 的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 ml，置 100 ml 量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對照溶液。
(2) 系統(tǒng)適用性試驗
取硫酸沙丁胺醇對照品（100328-200703）與硫酸特布他林對照品（100273-199701）
適量，加流動相溶解并稀釋制成每 1 ml 中各含約 0.2 mg 的溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液，經(jīng) 0.45μm 濾膜過濾后進樣分析，重復進樣 5 次。
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第三章 左旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液質(zhì)量研究 ...............42-55 
3.1 引言............................ 42-43 
3.2 材料與方法 ....................43-47 
3.2.1 實驗儀器與試劑 ..................43-44 
3.2.2 實驗方法....................... 44-45 
3.2.3 三批小試制劑的檢測與穩(wěn)定性考察................... 45-47 
3.3 結(jié)果與討論......................... 47-54 
3.3.1 不同結(jié)合鹽形式引濕性比較................... 47-48 
3.3.2 粉末衍射結(jié)果比較 ...........48-50 
3.3.3 三批小試制劑檢測 ........................50-54 
3.3.4 穩(wěn)定性考察................. 54 
3.4 本章小結(jié) .................................54-55 
第四章 霧化吸入溶液粒徑分布與劑量遞送研究................. 55-68 
4.1 引言 .......................55-59 
4.2 材料與方法 ......................59-62 
4.2.1 實驗儀器與試劑 .........................59-60 
4.2.2 實驗方法.......................... 60-62 
4.3 結(jié)果與討論 ..................62-67 
4.3.1 標準曲線 ................62-63 
4.3.2 粒徑分布 .................63-66 
4.3.3 劑量遞送 ..............................66-67 
4.4 本章小結(jié) ...................................67-68 

第五章 左旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液藥效作用研究

5.1 引言
哮喘是呼吸系統(tǒng)中的常見病與多發(fā)病，關(guān)于其發(fā)病機制、新療法的安全性以及可靠性評價和新藥研發(fā)中制劑的療效與作用評價都主要是依賴于動物實驗，但是動物自發(fā)形成的變應(yīng)性哮喘是很少見的，而動物與人體的差異性使得建立的動物哮喘模型很難完全的模擬人類哮喘，因此只能依據(jù)現(xiàn)有醫(yī)學知識，在動物身上模擬哮喘的某些特征。實驗室常用來模擬人類支氣管哮喘的動物種類很多，比如豚鼠、大鼠、小鼠、家兔等，本文中以豚鼠作為實驗動物。
豚鼠又稱荷蘭豬（Guniea pig），在動物學中的分類是哺乳綱嚙齒目豚鼠科豚鼠屬，豚鼠的生活習性和解剖生理特點使其成為研究呼吸系統(tǒng)疾病尤其是復制氣喘模型的首選動物，豚鼠對組織胺極敏感，所以很適合作平喘藥和抗組織胺藥的研究，被組胺致敏后的豚鼠，其支氣管的過敏反應(yīng)狀態(tài)正是常用的“速發(fā)型”支氣管收縮模型[105]。這種模型的發(fā)病機制與人類的哮喘癥相仿，同屬于 I 型變態(tài)反應(yīng)，可以很好的模擬人類哮喘急性發(fā)作中的病癥，比如氣急、喘息、呼吸困難等。以豚鼠來構(gòu)建哮喘模型有很多好處，它價格低廉，繁殖以及飼養(yǎng)簡便，被變應(yīng)原刺激后產(chǎn)生的支氣管收縮反應(yīng)與人類支氣管哮喘中的收縮特點相同，可以形成很好的氣道炎癥模型，對于抗哮喘藥物的初步作用機理以及藥效評價來說是很好的選擇。
沙丁胺醇是直接與支氣管平滑肌的 β2受體結(jié)合引起支氣管擴張，藥效發(fā)揮迅速，它主要用于哮喘急性發(fā)作時的癥狀緩解，避免患者因極度呼吸困難而窒息死亡，因此對于它的藥效作用評價最重要的是選擇能反映支氣管平滑肌狀態(tài)的生理指標。目前認為最主要的呼吸力學指標為肺功能的測定：氣道阻力和動態(tài)肺順應(yīng)性[106]。氣道阻力是指氣道內(nèi)單位流量所產(chǎn)生的壓力差。通常用(氣道口腔壓-肺泡壓)/流量來計算，以每秒鐘內(nèi)通氣量為 1L 時的壓力差來表示。臨床適用于各種阻塞性通氣功能障礙性疾病以及機械通氣和呼吸監(jiān)護等情況，氣道阻力的測定可以直接反映氣道的阻塞情況，通常支氣管哮喘、肺氣腫等呼吸系統(tǒng)方面的障礙疾病均可引起氣道阻力的增加。動態(tài)肺順應(yīng)性是指單位壓力改變時所引起的肺容積的改變，它代表了胸腔壓力改變對肺容積的影響，其監(jiān)測結(jié)果在臨床中可初步用于評價患者的肺功能。以上兩個指標相互結(jié)合可以很好的反映氣道的通氣功能，本章研究內(nèi)容正是基于氣道阻力和動態(tài)肺順應(yīng)性的測定來評判藥效作用。
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結(jié)論

1、本研究首先對硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液質(zhì)量標準進行了復核，對選用的色譜條件進行了全面驗證，并在實驗室條件下開始進行三批小試制劑的穩(wěn)定性考察，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)開展左旋硫酸沙丁胺醇霧化溶液的質(zhì)量研究，以合格原料藥制備了三批小試制劑并進行穩(wěn)定性考察。
2、粒度分布測試數(shù)據(jù)表明，自制左旋和消旋霧化溶液的 FPF%分別高達 72.81%和71.97%，MMAD 分別為 3.278 和 3.321，作為吸入制劑關(guān)鍵的評價標準與市售制劑具有一定的可比性，同時在模擬呼吸狀態(tài)下的藥物遞送劑量達到了 2.704 ug/s 和2.727 ug/s，藥物遞送能力的差異與市售制劑均無顯著性差異，一定程度上肯定了配方的合理性。
3、藥效學實驗證明，左旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入給藥可以發(fā)揮顯著的支氣管擴張作用，使豚鼠的氣道阻力上升率從 425.37%降低到 25.53%，動態(tài)肺順應(yīng)性的下降也得到了有效控制，而且這種藥效的發(fā)揮與加倍劑量給藥的消旋相比具有很好的一致性，更加支持了消旋體中是左旋體發(fā)揮療效的結(jié)論，同時左旋體、消旋體藥效在性別方面的差異得到了初步證實，而差異原因則有待于繼續(xù)研究。本文為左旋硫酸沙丁胺醇霧化吸入溶液的臨床前研究和上市打下了基礎(chǔ)，為該劑型突破國外技術(shù)壁壘應(yīng)用于中國市場提供了一定的指導，同時也為左旋硫酸沙丁胺醇其他劑型開發(fā)比如緩釋片、干粉吸入劑研究中的質(zhì)量控制和體外分析提供了借鑒和參考。
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本文編號：11595