【摘要】 背景：抗精神藥物為精神病的首選藥物,主要分為兩大類,第一代典型性抗精神藥物和第二代非典型性抗精神藥物。第一代抗精神藥物對精神分裂癥的陰性癥狀無明顯效果,引起藥源性錐體外系不良反應(yīng),尤其是不可逆的遲發(fā)性運動障礙的發(fā)生,嚴重地影響了患者的服藥依從性,也妨礙社會功能的恢復。第二代抗精神藥物在作用于DA受體的同時對于5-羥色胺(5-HT)受體具有更強的拮抗作用,不再引起藥源性錐體外系不良反應(yīng),但是仍有一定的副作用,比如氯氮平,但其致粒細胞缺乏的發(fā)生率高達1‰～3‰,是其它抗精神病藥的50-100倍,致使臨床應(yīng)用受到明顯的限制。作為第二代抗精神藥物的代表Olanzapine對5-HT受體親和力高于DA受體的親和力,且選擇性作用于與精神活動關(guān)系密切的中腦邊緣系統(tǒng),因此對精神分裂癥的陰性癥狀具有良好的療效,對難治性精神分裂癥也有較好的效果,且很少引起致粒細胞缺乏。但是也引起一些不良反應(yīng),比如脂類代謝紊亂,伴隨有血脂異常、肥胖、糖尿病、心血管疾病及炎癥等,尤其是血脂異常很普遍。由于臨床還沒有可以取代Olanzapine的藥物出現(xiàn),故Olanzapine的應(yīng)用還是很廣泛,于是在臨床上尋找與Olanzapine聯(lián)合用的,能改善抗精神病藥物誘導的脂代謝異常的藥物就顯得很是迫切。Olanzapine引起脂代謝紊亂具體機制還不是很清楚,現(xiàn)已有報道其副作用與H1受體、脂肪生成因子以及SREBPs途徑均有關(guān)系。最近有文獻稱Olanzapine的脂代謝紊亂有可能還具有反饋調(diào)節(jié)作用。他汀類藥物,為降血脂的一線藥物,可通過競爭性抑制HMG-CoA還原酶,在減少肝臟合成膽固醇的同時,還能增加ILDLC受體數(shù)量和活性、增加血清膽固醇的清除,進一步降低TC水平。那么能否推測他汀類藥物可以通過SREBPs相關(guān)途徑來抑制Olanzapine引起的HMG-CoA還原酶增強,從而干預Olanzapine引起的脂代謝變化,值得關(guān)注。此外,Berberine是從小檗屬、黃連屬植物根莖中提取的一種異喹啉類季銨生物堿,主要用于腸道炎癥伴發(fā)熱,具有抗菌、止瀉、抗心律失常、抗高血壓、降血脂等作用�，F(xiàn)有較多文獻報道Berberine降血脂效果較顯著,其具體機制還不是很清楚。有文獻報道通過Berberine通過調(diào)節(jié)SREBPs相關(guān)途徑(包括PPAR γ和C/EBP α),抑制3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞、人類白前脂肪細胞以及高脂肪飲食誘導的肥胖鼠模型中的脂肪細胞分化過程中脂肪生成。因此Berberine與Olanzapine聯(lián)合用藥,能否干預Olanzapine介導的3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞脂代謝變化,從而應(yīng)用于臨床上Olanzapine引起的脂代謝紊亂,值得研究。目的：在3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞(前脂肪細胞)水平上,建立Olanzapine誘發(fā)脂代謝的成熟脂肪細胞模型,研究Olanzapine通過SREBPs途徑誘發(fā)的脂代謝副作用,分析他汀類藥物和Berberine對其的干預作用及其分子機制。方法：采用MTT比色法考察DMSO、Olanzapine、Simvastatin、Atorvastatin、Berberine等對3T3-L1細胞增殖的影響,從而找出上述藥物具有較低細胞毒性的濃度范圍；利用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、油紅O染色脂滴,試劑盒檢測TG、TC含量,RT-qPCR基因轉(zhuǎn)錄分析及Western blotting分析蛋白表達四個方面來考察Olanzapine是否成功誘導形成成熟脂肪細胞模型,并且選出最佳的Olanzapine濃度；在此基礎(chǔ)上選擇以上四個方面來研究他汀類藥物和Berberine是否干預Olanzapine介導的脂代謝變化以及相關(guān)分子機制。結(jié)果：1. Olanzapine介導的脂代謝變化細胞模型的建立Olanzapine能促進脂肪細胞脂滴的形成,在低于10μmol/L濃度,呈劑量依賴性,超過10μmol/L后誘導效果不明顯。并且在10μmol/L濃度時對TG, TC含量、基因轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達水平都有一定的下調(diào)作用。2. Simvastatin對Olanzapine引起的脂代謝變化的干預作用在2.5μmol/L和5μmol/L Simvastatin作用下,可看到細胞形態(tài)觀察的改變以及油紅O染色脂滴數(shù)量的下降,TG, TC含量測定、基因轉(zhuǎn)錄分析及蛋白表達水平方面都進一步驗證了Simvastatin可以干預Olanzapine引起的脂代謝變化。3. Atorvastatin對Olanzapine誘發(fā)的脂代謝變化的影響在2.5μmol/L和5μmol/L Atorvastatin作用下,基本上看不到細胞形態(tài)觀察的改變以及油紅O染色脂滴數(shù)量的下降,在TG、TC含量測定、基因轉(zhuǎn)錄分析及蛋白表達水平等方面也沒有較大的變化。4. Berberine對Olanzapine介導的脂代謝變化的效應(yīng)在1.25μmol/L和2.5μmol/L Berberine作用下,可明顯看到細胞形態(tài)觀察的改變以及油紅O染色脂滴數(shù)量的下降,TG, TC含量測定、基因轉(zhuǎn)錄分析及蛋白表達水平方面都進一步驗證了Berberine可以干預Olanzapine引起的脂代謝變化。結(jié)論：本研究分析了Olanzapine介導的3T3-L1脂肪細胞脂代謝特征,建立了相應(yīng)的細胞模型。通過應(yīng)用此模型,篩選到Simvastatin和Berberine與Olanzapine聯(lián)合用藥,能在一定程度上干預SGAs的代表藥物olanzapine引起的脂代謝副作用,為臨床上聯(lián)合用藥提供理論基礎(chǔ)。 

第1章綜述

1.1抗精神病藥物
抗精神病藥(Antipsychotic Drug)主要用于治療精神分裂癥及其他精神失常的狂躁癥狀。目前為止精神異常疾病的首選治療仍為各類抗精神病藥，主要包括兩個大類：即第一代抗精神病藥(First Generation Antipsychotic Drugs, FGAs)，又稱典型性抗精神病藥,其主要為DA2受體阻斷劑，如氯丙嗪(Chloropromazine)，氟呢淀醇(Haloperidol，HAL)等；第二代抗精神病藥(Second Generation Antipsychotic Drugs, SGAs),又稱非典型性抗精神病藥，如氯氮平(Clozapine)、奧氮平(Olanzapine)、奎硫平(Quetiapine)、利培酮(Risperidone)、舍 B引哚(Sertindole)、齊拉西酮(Ziprasidone)等，在作用于DA受體的同時對5-HT受體具有更強的拮抗作用，不再引起藥源性錐體外系不良反應(yīng)。FGAs的近期療效僅為50%?60%，對精神分裂癥陽性癥狀的改善效果顯著，但卻無法改善精神分裂癥的陰性癥狀，引起很嚴重的藥源性錐體外系不良反應(yīng)，特別是能造成不可逆的遲發(fā)性運動障礙，嚴重地影響了患者的服藥依從性及妨礙社會功能的恢復[3]。而SGAs在作用于DA受體的同時對于5-HT受體具有更強的抬抗作用，對精神分裂癥陽性和陰性癥狀都有效，尤其是對精神分裂癥的陰性癥狀作用明顯，也可減輕伴發(fā)的抑郁、焦慮及認知缺陷等癥狀，較少引起錐體外系不良反應(yīng)及遲發(fā)性運動障礙，具有較好的遠期療效[4]。由于其具有廣譜且可忍受的副作用，SGAs已經(jīng)替代傳統(tǒng)的抗精神病藥，成為一線抗精神病藥。近年來，研究顯示SGAs還具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)、保護作用。
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1.2抗精神藥物Olanzapine誘發(fā)的脂代謝變化及其相關(guān)機制
目前臨床上Olanzapine的副作用有代謝性疾病特征，伴隨有血脂異常、肥胖、心血管疾病，血糖失調(diào)(糖尿病、葡萄糖耐受措抗)以及一些炎癥等。其中比較顯著的副作用為為脂代謝紊亂，甚至在一些研究中有報道Olanzapine能引起血清膽固醇水平升高由于這些副作用的存在，造成了心血管患者的死亡率增加，患者的服藥順從性降低，使其在治療精神病方面受到了一定的限制[12]?雖然存在這些問題，但是由于臨床還沒有可以取代Olanzapine的藥物出現(xiàn)，所以O(shè)lanzapine的應(yīng)用還是很廣泛，于是臨床尋找改善抗精神病藥誘導的脂代謝異常的藥物就很是迫切[13]。
抗精神藥物的副作用脂代謝紊亂似乎與大腦的D2受體阻滯相關(guān)，具體分子機制還不是很清楚。通過對下丘腦5-HTC和HI受體的拮抗作用，筆耕文化推薦期刊，抗精神藥物誘導的體重增加似乎與食欲刺激相關(guān),也有可能與其他機制也相關(guān)。
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第2章材料與方法

2.1主要材料
2.1.1細胞系
小鼠胚胎成纖維細胞系3T3-L1(購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心)；
2.1.2主要試劑
Olanzapine(購自大連美企生物技術(shù)有限公司批號：132539-06-1)；Rosiglitazone(購自大連美企生物技術(shù)有限公司批號：122320-73-4);
Simvastatin(購自大連美倉生物技術(shù)有限公司批號：79902-63-9)
Atorvastatin(購自大連美企生物技術(shù)有限公司批號：134523-03-8
)Berberine(購自中國藥品生物制品檢定所批號：110713)
Insulin (購自 Sigma 批號：15500)
IBMX(購自Sigma公司批號：15879)
Dexamethasone(購自上海生工生物批號：DN1187)
D-Biotiii(購自上海生工生物批號：BB0078)
DMEM-High細胞培養(yǎng)基(購自Hyclone);
胎牛血清(購自Hyclone);
RNA Simple Total RNAKiUTIANGEN 生物技術(shù)公司批號：DP419)
Transcriptor First Strand DNA Synthesis Kit (Roche 公司批號：0489686600)
SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems 公司，4472897)
RIPA蛋白提取液提取液(購自北京鼎國昌盛生物公司貨號：WB-007)
Easy Protein Quantitative Kit(TransGen 公司貨號：DQ101-01)
Anti-LDL Receptor antibody (Abeam 公司批號：ab30532)Anti-SREBP2 antibody (Abeam 公司批號：ab30682)
p -Actin Rabbit Polyclonal Antiboby(北京鼎國昌盛生物公司，批號：AC001-R);
Anti-RbIgG(H+L)/HRP(北京鼎國昌盛生物公司批號：ffl-0011)
ECL顯影劑(Genview公司）DMSO(Sigma公司，鼎國分裝)；
甘油三醋(TG)測試盒(南京建成生物工程研究所貨號：F001-2)
總膽固醇(TC)測試盒(南京建成生物工程研究所貨號：F002-2)
其他化學試劑均購自上海生工和鼎國生物。
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2.2方法
2.2.1細胞培養(yǎng)
(-)細胞培養(yǎng)及形態(tài)學觀察
3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基含10%胎牛血清的DMEMH完全培養(yǎng)基，含lOOIU/mL青霉素、lOOug/mL鏈霉素，其培養(yǎng)在37°C，含5%C02,飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱。成纖維細胞需要每3天換一次液。一般大概3天細胞會分裂鋪滿培養(yǎng)皿的50%，這個時候需要消化傳代。一定不要讓它長的超過皿的70%。如果細胞長滿，超過24h,傳代后，細胞就不能很好的分化。在細胞傳代20次后就不要再傳代了，因為這樣的話，細胞就不會很好的分化了。所以在每次傳代后，要做好標記。
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第3章 實驗結(jié)果 ................................31-51 
3.1 誘導3T3-L1前脂肪細胞分化為脂肪細胞 ..................31 
3.2 藥物對3T3-L1細胞增殖的影響............. 31-35 
3.2.1. DMSO對3T3-L1細胞增殖的影響 ..........................31-32 
3.2.2. Olanzapine對3T3-L1細胞增殖的影響 ............32-33 
3.2.3. Simvastatin對3T3-L1細胞增殖的影響 .....................33-34 
3.2.4. Atorvastatin對3T3-L1細胞增殖的影響............. 34 
3.2.5. Berberine對3T3-L1細胞增殖的影響 ................34-35 
3.3 Olanzapine對成熟脂肪細胞脂代謝的影響 ..........35-38 
3.3.1. 油紅O染色觀察脂肪滴的變化.......................... 35-36 
3.3.2. Olanzapine介導的脂肪細胞TG、TC含量的檢測 ....................36 
3.3.3. Olanzapine介導的脂肪細胞的相關(guān)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平分析.......................... 36-38 
3.4 Simvastatin對Olanzapine介導的脂代謝變化的影響 ................38-42 
3.4.1. 油紅O染色觀察脂肪滴的變化 ........................38-39 
3.4.2. Simvastatin對Olanzapine介導的TG、TC含量的變化 ...........................................39-40 
3.4.3. Simvastatin聯(lián)合Olanzapine條件下的相關(guān)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平分析 ..................40-41 
3.4.4. Simvastatin與Olanzapine共同作用下SREBP2和LDLR蛋白的表達分析 ................................41-42 
3.5 Atorvastatin對Olanzapine介導的脂代謝變化的干預 .........................42-46 
3.5.1. 油紅O染色觀察脂肪滴變化 .............................42-43 
3.5.2. Atorvastatin對Olanzapine介導的TG、TC含量的調(diào)控 ..................43 
3.5.3. Atorvastatin聯(lián)合Olanzapine條件下的相關(guān)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平分析.................................. 43-45 
3.5.4. Atorvastatin與Olanzapine聯(lián)合對SREBP2和LDLR蛋白的表達調(diào)控情況........................... 45-46 
3.6 Berberine對Olanzapine介導的脂代謝變化的影響 ...........46-51 
3.6.1. 油紅O染色觀察脂肪滴變化........................ 46-47 
3.6.2. Berberine對Olanzapine介導的TG、TC含量的影響.............................. 47 
3.6.3. Berberine聯(lián)合Olanzapine條件下的相關(guān)調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析.......................... 47-49 
3.6.4. Berberine與Olanzapine聯(lián)合對SREBP2和LDLR蛋白表達的調(diào)控情況 ...........................49-51 

第4章 討論與分析

當前社會生活節(jié)奏越來越快，生活壓力也越來越大，導致精神方面的疾病也越來越多。由于第二代抗精神藥物SGAs具有廣譜且可忍受的副作用，SGAs已經(jīng)替代傳統(tǒng)的抗精神病藥，成為當前臨床上治療精神分裂癥及其他精神失常的狂躁癥狀的首選藥。目前，臨床上Olanzapine的副作用主要為代謝紊亂，比如肥胖、高甘油三酷血癥、血糖失調(diào)(糖尿病、葡萄糖耐受拮抗)等，尤其是脂代謝素亂已經(jīng)影響了患者的服藥順從性，所以尋找能干預脂代謝紊亂的藥物就顯得很是迫切。
4.1  Olanzapine介導的3T3-L1脂肪細胞脂代謝變化模型的建立
脂代謝紊亂是SGAs治療精神失常的過程中引起的主要副作用之一。由于該副作用的存在，增加了心血管患者的致死率，降低了患者的服藥順從性，使其在臨床上的應(yīng)用受到的一定的限制。本研究中，我們選0.1%DMSO為對照組，不同濃度的Olanzapine均能一定程度的促進3T3-L1脂肪細胞脂滴數(shù)量和體積的增加，50 jimol/L Olanzapine誘導3T3-L1脂肪細胞脂滴生成的效果次于10 nmol/L Olanzapine;并且與對照組相比，經(jīng)過Olanzapine處理的脂肪細胞的TG、TC含量均有一定的增加，在前呈上升趨勢，而在50 jmiol/L處稍有下降。1 nmol/L Rosiglitazone, PPARy激動劑，作為陽性對照，能顯著性的促進脂肪的生成。由圖8可知，隨著Olanzapine濃度的加大，它對3T3-L1細胞的毒性增加，當高于50 jimol/LOlanzapine對3T3-L1細胞的毒性已經(jīng)大于20%，抑制前脂肪細胞分化為脂肪細胞。故lO^mol/L Olanzapine能最大程度的誘導成熟的脂肪細胞的脂滴形成，建立較佳的脂代謝變化細胞模型，為后面的他汀類藥物和Berberine干預Olanzapine引起的脂代謝變化提供模型。通過對基因轉(zhuǎn)錄差異分析檢測，10iimol/L Olanzapine均能顯著性的上調(diào)Ppary、C/EBPa、Srebpl、Srebp2、HmgcR和LdlR基因的表達，其對這6個基因的調(diào)控能力明顯高于其他濃度的Olanzapine0進一步驗證了，Olanzapine能通過SREBPs途徑介導3T3-L1脂肪細胞的脂代謝變化。
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結(jié)論

1.Olanzapine介導的脂代謝變化細胞模型的建立
Olanzapine能促進脂肪細胞脂滴的形成，在低于10 nmol/L濃度，呈劑量依賴性，超過10nmol/L后誘導效果不明顯。并且在10 pmol/L濃度時對TG、TC含量、基因轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達水平都有一定的下調(diào)作用。
2.Simvastatin對Olanzapine引起的脂代謝變化的干預作用
在2.5 ^mol/L和5 nmol/L Simvastatin作用下,可看到細胞形態(tài)觀察的改變以及油紅0染色脂滴數(shù)量的下降，TG、TC含量測定、基因轉(zhuǎn)錄分析及蛋白表達水平方面都進一步驗證了Simvastatin可以干預Olanzapine引起的脂代謝變化。
3.Atorvastatin對Olanzapine誘發(fā)的脂代謝變化的影響
在2.5 nmol/L和5 |umol/L Atorvastatin作用下，基本上看不到細胞形態(tài)觀察的改變以及油紅0染色脂滴數(shù)量的下降，在TG、TC含量測定、基因轉(zhuǎn)錄分析及蛋白表達水平等方面也沒有較大的變化。
4.Berberine對Olanzapine介導的脂代謝變化的效應(yīng)
在1.25 |xmol/L和2.5 |xmol/L Berberine作用下，可明顯看到細胞形態(tài)觀察的改變以及油紅0染色脂滴數(shù)量的下降，TG、TC含量測定、基因轉(zhuǎn)錄分析及蛋白表達水平方面都進一步驗證了 Berberine可以干預Olanzapine引起的脂代謝變化。
本研究分析了 Olanzapine介導的3T3-L1脂肪細胞脂代謝特征，建立了相應(yīng)的細胞模型。通過應(yīng)用此模型，蹄選到Simvastatin和Berberine與Olanzapine聯(lián)合用藥，能在一定程度上干預SGAs的代表藥物olanzapine引起的脂代謝副作用，為臨床上聯(lián)合用藥提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻：

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[3] Ping Yi, Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China Fu-Er Lu, Li-Jun Xu, Guang Chen, Kai-Fu Wang, Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China.  Berberine reverses free-fatty-acid-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes through targeting IKKβ[J]. World Journal of Gastroenterology. 2008(06)


本文編號：10807