發(fā)布時(shí)間：2014-12-20 11:59

 

【摘要】 膠類藥材是我國(guó)中藥寶庫(kù)中一類特殊的動(dòng)物藥,是由動(dòng)物的皮、骨骼等經(jīng)特殊工藝加工而成,常見的有阿膠、鹿角膠、龜甲膠及其相關(guān)中成藥制劑,如復(fù)方阿膠漿、龜鹿二仙膏等。近年來(lái),由于動(dòng)物膠類藥材的生產(chǎn)原料短缺,價(jià)格昂貴,部分生產(chǎn)企業(yè)為降低成本,用雜皮膠投料違法生產(chǎn)的情況比較嚴(yán)重,同時(shí)在高價(jià)膠類藥材(龜甲膠及鹿角膠)生產(chǎn)過(guò)程中摻加低價(jià)膠類(阿膠或明膠)藥材非法謀利的情況屢見不鮮,導(dǎo)致膠類藥材的質(zhì)量參差不齊、市場(chǎng)秩序非常混亂。然而,由于目前膠類藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)整體水平較低,長(zhǎng)期缺乏專屬性鑒別方法和高靈敏度的檢測(cè)技術(shù),面對(duì)以上質(zhì)量問(wèn)題,藥品檢驗(yàn)和監(jiān)管部門往往束手無(wú)策。因此,建立準(zhǔn)確性好、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的動(dòng)物膠類藥材的質(zhì)量控制技術(shù)和方法,并應(yīng)用于相關(guān)藥品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中,必將極大推進(jìn)我國(guó)膠類藥品質(zhì)量監(jiān)管的科學(xué)性與有效性,對(duì)保障公眾用藥安全有效、維護(hù)市場(chǎng)公平公正以及保護(hù)消費(fèi)者利益等方面產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。本學(xué)位論文依據(jù)不同動(dòng)物因物種差異,其膠原蛋白氨基酸序列必然存在一定的差異這一原理,采用液質(zhì)聯(lián)用多肽識(shí)別技術(shù)和數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)蛋白質(zhì)酶解后的膠類樣品(主含多肽混合物)進(jìn)行分析處理,尋找并發(fā)現(xiàn)各膠類樣品的特征肽段,同時(shí)借用近年來(lái)蛋白質(zhì)及多肽序列研究的技術(shù)方法和成果,從分子層次研究各膠類藥材的主體組分性質(zhì)及具有專屬性鑒別意義的特征多肽成分,從而建立基于膠原蛋白序列差異的膠類藥材真?zhèn)舞b別方法。以期從根本上為膠類藥材的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供技術(shù)依據(jù)。論文圍繞以上思路主要開展了以下幾個(gè)方面的研究工作,并取得了一些創(chuàng)新性結(jié)果：一、采用蛋白質(zhì)酶切技術(shù)和液質(zhì)聯(lián)用多肽識(shí)別技術(shù)對(duì)膠類藥材進(jìn)行研究。選擇胰蛋白酶對(duì)鹿角膠、龜甲膠、阿膠、黃明膠、新阿膠的膠原蛋白進(jìn)行酶解,得到酶解肽,進(jìn)而采用液質(zhì)聯(lián)用多肽識(shí)別技術(shù),建立5種膠類藥材酶解肽圖。并結(jié)合MakerLnyx軟件,進(jìn)行主成分分析和因子分析,找出了鹿角膠2個(gè)特征離子,龜甲膠3個(gè)特征離子,阿膠4個(gè)特征離子,黃明膠4個(gè)特征離子,新阿膠4個(gè)特征離子。進(jìn)一步對(duì)各膠類特征離子的二級(jí)圖譜的分析,結(jié)合MASCOT檢索,鑒定了鹿角膠1個(gè)特征離子的序列,龜甲膠3個(gè)特征離子的序列,阿膠4個(gè)特征離子的序列,黃明膠4個(gè)特征離子的序列,新阿膠3個(gè)特征離子的序列。并按解析出的序列,進(jìn)行化學(xué)合成,驗(yàn)證了部分序列的正確性。二、以鹿角膠的特征肽m/z732.8. m/z765.4,龜甲膠的特征肽m/z745.8, m/z631.3, m/z758.4,阿膠的特征肽m/z765.9, m/z618.8, m/z539.8,黃明膠的特征肽m/z641.3、m/z790.9, m/z604.8,及新阿膠的特征肽m/z925.4, m/z774.3.m/z739.8作為母離子,采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),建立了各種膠類的特征圖譜和質(zhì)譜信息庫(kù),繼而形成了膠類藥材真?zhèn)舞b定和快速篩查智能檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。三、以標(biāo)準(zhǔn)化方法建立為目標(biāo),本研究開展了檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作,首次研制標(biāo)定出鹿角膠、龜甲膠、黃明膠對(duì)照藥材和牛皮特征肽A對(duì)照品。并采用高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),以鹿角膠、龜甲膠、阿膠、黃明膠對(duì)照藥材和牛皮特征肽A為對(duì)照,建立了鹿角膠、龜甲膠、阿膠的定性鑒別方法和用于打擊違法使用雜皮投料生產(chǎn)龜甲膠、鹿角膠、阿膠的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。四、以膠原蛋白中的特殊氨基酸—羥脯氨酸為主要指標(biāo),建立了異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定膠類藥材中4種主要氨基酸(羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸)的含量測(cè)定方法,并進(jìn)行了方法學(xué)的驗(yàn)證,提出了阿膠中4種主要氨基酸含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)草案。本論文的特色與創(chuàng)新之處：(1)首次通過(guò)酶切技術(shù)及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)技術(shù),確定各不同膠類藥材的專屬性特征肽段,并通過(guò)氨基酸序列分析和特征肽段的化學(xué)合成等手段,驗(yàn)證了特征肽段序列的正確性；(2)首次將肽圖分析和數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法應(yīng)用于膠類藥材的真?zhèn)舞b定。通過(guò)各種膠類藥材樣品的色譜質(zhì)譜信息庫(kù)(色譜參數(shù)、質(zhì)譜參數(shù)、特征肽段信息等)的建立和應(yīng)用,首次建立膠類藥材真?zhèn)巫R(shí)別專家系統(tǒng)；(3)首次建立了分析檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及鹿角膠、龜甲膠、阿膠專屬性強(qiáng)的膠類藥材定性鑒別標(biāo)準(zhǔn)方法；(4)首次建立正品膠類藥材中摻加雜皮的檢測(cè)方法,并申報(bào)國(guó)家補(bǔ)充檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)。

前言

膠類藥材是特殊的動(dòng)物藥，常見的有阿膠、龜甲膠及其相關(guān)中成藥制制，如復(fù)方阿膠漿、龜鹿二仙膏等。分生產(chǎn)企業(yè)并非用真正龜甲、鹿角，驢皮，而是以雜皮如牛皮投料。更有甚者，以腐爛變質(zhì)的雜皮或工業(yè)皮革下腳料投料生產(chǎn)。嚴(yán)重影響了藥品市場(chǎng)秩序及廣大人民群眾的飲食用藥安全。央視再度曝光，不法廠家竟然將腐爛變質(zhì)的雜皮或混了牛皮的邊腳料做原料，更有甚者使用皮革下腳料投料來(lái)生產(chǎn)阿膠，給消費(fèi)者的健康帶來(lái)嚴(yán)重的隱患。無(wú)論是藥品標(biāo)準(zhǔn)還是食品標(biāo)準(zhǔn)均無(wú)專屬性強(qiáng)、靈敏度高的方法，對(duì)以上違法行為進(jìn)行有效打擊，無(wú)法有效保證公眾飲食用藥安全和保護(hù)消費(fèi)者的利益。因此，針對(duì)以上膠類中藥的質(zhì)量問(wèn)題，研究建立一系列行之有效的專屬性鑒別方法和標(biāo)準(zhǔn)，并推廣應(yīng)用于相關(guān)藥品的質(zhì)量控制和市場(chǎng)監(jiān)管中，對(duì)有效打擊相關(guān)假冒偽劣產(chǎn)品的違法行為，正本清源，扶正祛邪，并保障人民飲食用藥安全必將產(chǎn)生極大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，十分迫切，意義重大。
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第一章概述

這些方法都是蛋白質(zhì)類成分的通用檢測(cè)方法，專屬性不強(qiáng)。加之，在制膠過(guò)程中，水解工藝的不同，可造成膠原分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、水解肽種類、水解肽分子量大小、水解肽的物理性質(zhì)不同，直接影響上述方法測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性。另外上述方法只是對(duì)正品和純偽品的鑒別，而對(duì)于正品中摻加部分偽品（雜皮）的問(wèn)題無(wú)能為力。這些方法都是蛋白質(zhì)類成分的通用檢測(cè)方法，專屬性不強(qiáng)。加之，在制膠過(guò)程中，水解工藝的不同，可造成膠原分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、水解肽種類、水解肽分子量大小、水解肽的物理性質(zhì)不同，直接影響上述方法測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性。另外上述方法只是對(duì)正品和純偽品的鑒別，而對(duì)于正品中摻加部分偽品（雜皮）的問(wèn)題無(wú)能為力。這些方法都是蛋白質(zhì)類成分的通用檢測(cè)方法，專屬性不強(qiáng)。加之，在制膠過(guò)程中，水解工藝的不同，可造成膠原分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、水解肽種類、水解肽分子量大小、水解肽的物理性質(zhì)不同，直接影響上述方法測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性。另外上述方法只是對(duì)正品和純偽品的鑒別，而對(duì)于正品中摻加部分偽品（雜皮）的問(wèn)題無(wú)能為力。這些方法都是蛋白質(zhì)類成分的通用檢測(cè)方法，專屬性不強(qiáng)。加之，在制膠過(guò)程中，水解工藝的不同，可造成膠原分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、水解肽種類、水解肽分子量大小、水解肽的物理性質(zhì)不同，直接影響上述方法測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性。另外上述方法只是對(duì)正品和純偽品的鑒別，而對(duì)于正品中摻加部分偽品（雜皮）的問(wèn)題無(wú)能為力。

第三章膠類藥材專屬性鑒別信息庫(kù)的建立............57
第一節(jié)特征圖譜的建立..........57
第二節(jié)智能信息庫(kù)的建立..................69
第四章膠類藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)方法研究.....................71
第一節(jié)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制.................71
第二節(jié)鹿角膠定性鑒別標(biāo)準(zhǔn)方法研究.....................77
第三節(jié)龜甲膠定性鑒別標(biāo)準(zhǔn)方法研究..................83
第四節(jié)阿膠定性鑒別標(biāo)準(zhǔn)方法研究............................89
第五章總結(jié)與討論...................143

第四章膠類藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)方法研究

第一節(jié)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)中不可缺少的組成部分，本部分研究工作中，首先開展標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作。關(guān)于氧基酸的測(cè)定方法有柱前衍生化和柱后衍生化。經(jīng)典的氣基酸分析方法是釆用柱后衍生、用審三酮作為衍生試劑的離子交換色譜法。此法需專門的儀器，分析時(shí)間也較長(zhǎng)。隨著技術(shù)的發(fā)展用反相柱、柱前衍生化法測(cè)定氣基酸取得了很大發(fā)展。該法快速和實(shí)驗(yàn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)其中法是因與氨基酸和亞氣基酸均能反應(yīng)，并且生成產(chǎn)物穩(wěn)定，而成為目前氣基酸分析中具有吸引力的分析方法之一。為此，研究建立了阿膠中經(jīng)脯氣酸、甘氨酸、丙氧酸、脯氨酸種氣基酸的測(cè)定方法。

第二節(jié)鹿角膠定性鑒別方法研究
酸水解是氨基酸測(cè)定中最常用的樣品制備方法。然而該方法可引起一些氣基酸的破壞或部分破壞，并由此帶來(lái)分析結(jié)果的變動(dòng)。其中色氨酸被破壞，絲氨酸和蘇氣酸部分被破壞，蛋氣酸易被氧化，半耽氨酸一般轉(zhuǎn)化為胱氛酸。由于本實(shí)驗(yàn)只測(cè)定輕脯氨酸、甘氣酸、丙氣酸、脯氨酸，這4種氣基酸不易被酸氧化破壞，故本實(shí)驗(yàn)仍采用酸水解法。本研究開展了檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作，首次研制標(biāo)定出鹿角膠、龜甲膠、黃明膠對(duì)照藥材和牛皮特征肽對(duì)照品。并釆用高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以鹿角膠、龜甲膠、阿膠、黃明膠對(duì)照藥材和牛皮特征肽為對(duì)照，建立了鹿角膠、龜甲膠、阿膠的定性鑒別方法和用于打擊違法使用雜皮投料生產(chǎn)龜甲膠、鹿角膠、阿膠的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。
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第五章總結(jié)與討論

本論文的創(chuàng)新之處：首次通過(guò)酶切技術(shù)及高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，確定各不同膠類藥材的專屬性特征肽段，并通過(guò)氨基酸序列分析和特征肽段的化學(xué)合成等手段，驗(yàn)證了特征肽段序列的正確性；首次將肽圖分析和數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法應(yīng)用于膠類藥材的真?zhèn)舞b定。通過(guò)各種膠類藥材樣品的色譜質(zhì)譜信息庫(kù)的建立和應(yīng)用，首次建立膠類藥材真?zhèn)巫R(shí)別專家系統(tǒng)；首次建立了分析檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及鹿角膠、龜甲膠類藥材定性鑒別標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究所建立的相關(guān)檢測(cè)方法和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)將應(yīng)用于藥品、保健食品、食品的質(zhì)量控制和市場(chǎng)監(jiān)管。對(duì)提升整個(gè)產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量和技術(shù)水平，保障公眾用藥安全有效，筆耕文化推薦期刊，維護(hù)消費(fèi)者經(jīng)濟(jì)權(quán)益等方面，將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的意義。
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參考文獻(xiàn):
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本文編號(hào)：10483