本文關(guān)鍵詞：α-黑素細(xì)胞刺激素對谷氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜興奮性毒性的保護(hù)作用

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【摘要】：背景青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性是目前全球常見的三種不可逆致盲性眼病,上述疾病在具有各自典型病理過程的同時(shí)又存在一種普遍病理狀態(tài)----視網(wǎng)膜興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的濃度升高。高濃度谷氨酸會造成視網(wǎng)膜的興奮性毒性,而文獻(xiàn)報(bào)道α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)可拮抗谷氨酸興奮性毒性而導(dǎo)致的腦部海馬神經(jīng)元凋亡和膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生。目的建立體外雞胚視網(wǎng)膜組織塊培養(yǎng)體系,并利用該體系研究α-MSH對谷氨酸誘導(dǎo)視網(wǎng)膜興奮性毒性的保護(hù)作用;利用出生不久的雛雞進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)注射,進(jìn)一步在體內(nèi)研究α-MSH對谷氨酸誘導(dǎo)視網(wǎng)膜興奮性毒性的保護(hù)作用。方法體外實(shí)驗(yàn):選取胚胎第9天(E9)的雞胚視網(wǎng)膜建立組織塊培養(yǎng)體系。分別用含10%和15%胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)組織塊,常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色對比兩種條件下視網(wǎng)膜發(fā)育情況確定培養(yǎng)條件。然后對此培養(yǎng)條件下的體外培養(yǎng)第3、5、7天(3DIV、5DIV、7DIV)的視網(wǎng)膜組織塊及相應(yīng)的第12、14、16天(E12、E14、E16)的雞胚視網(wǎng)膜行HE染色,觀察各標(biāo)本的視網(wǎng)膜形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)。在谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性實(shí)驗(yàn)中,將視網(wǎng)膜組織塊分為單純谷氨酸刺激組、α-MSH+谷氨酸刺激組以及正常培養(yǎng)組,谷氨酸處理視網(wǎng)膜組織塊24h、48h,CCK-8法檢測各組視網(wǎng)膜組織塊培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)活性;TUNEL染色法檢測各組視網(wǎng)膜組織塊中細(xì)胞凋亡情況并進(jìn)行定量分析;RT-PCR法檢測各組視網(wǎng)膜組織塊中各型一氧化氮合酶(eNOS、nNOS、iNOS)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的基因表達(dá)。體內(nèi)試驗(yàn):選取出生后1天(P1)的雛雞為研究對象,分成谷氨酸組、α-MSH+谷氨酸組以及正常組,其中α-MSH+谷氨酸組先經(jīng)玻璃體腔注射α-MSH,谷氨酸組和正常對照組均注射純水。24h后單純谷氨酸組以及α-MSH+谷氨酸組行玻璃體腔谷氨酸注射,谷氨酸處理48h后所有動物行ERG檢測,然后處死動物取眼球石蠟切片行HE染色,觀察視網(wǎng)膜形態(tài)及組織結(jié)構(gòu),TUNEL染色法檢測各組視網(wǎng)膜中細(xì)胞凋亡情況并進(jìn)行定量分析。結(jié)果體外試驗(yàn):1.15%FBS相比10%FBS培養(yǎng)條件下,在3DIV時(shí)視網(wǎng)膜全層厚度增加(P0.05);5DIV時(shí)視網(wǎng)膜外核層(P0.05)、內(nèi)核層(P0.001)、全層(P0.001)厚度顯著增加;7DIV時(shí)上述視網(wǎng)膜外核層、內(nèi)核層、全層厚度在兩種培養(yǎng)條件下無差異(P0.05),視網(wǎng)膜組織塊中3DIV、5DIV、7DIV各層組織結(jié)構(gòu)與E12、E14和E16的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)相似。2.各組處理24h后,單純谷氨酸組織塊培養(yǎng)基中LDH活性較正常對照組顯著增加(P0.001),而α-MSH可阻止這一酶活性增加(P=0.197,α-MSH+谷氨酸刺激組vs正常對照組);處理48h之后,各組LDH活性相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.TUNEL染色顯示單純谷氨酸刺激雞胚視網(wǎng)膜組織24h后視網(wǎng)膜內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞出現(xiàn)凋亡;48h后,視網(wǎng)膜內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞大量凋亡,外核層亦有少量凋亡細(xì)胞,DAPI染色結(jié)果表明視網(wǎng)膜各層排列紊亂。α-MSH+谷氨酸刺激組視網(wǎng)膜組織塊較單純谷氨酸刺激組結(jié)構(gòu)明顯規(guī)整,視網(wǎng)膜各層清晰可見,內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層有少許凋亡細(xì)胞。定量結(jié)果表明,谷氨酸刺激24h后,各組凋亡細(xì)胞總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.028,P=0.000)。48h后,各組凋亡細(xì)胞總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1422.890.P=0.000)。單純谷氨酸刺激組48h凋亡數(shù)量為24h的18倍。兩時(shí)點(diǎn)α-MSH+谷氨酸刺激組凋亡細(xì)胞數(shù)量均明顯少于單純谷氨酸刺激組,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000):α-MSH+谷氨酸刺激組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)量與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24hP =0.205,48hP =0.640)。4.Real-time PCR結(jié)果顯示,在處理24h后,單純谷氨酸處理可使eNOS和GFAP mRNA水平較正常對照組顯著上調(diào)(P0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而α-MSH的加入使eNOS、GFAP和iNOSmRNA水平顯著低于單純谷氨酸處理組(P0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:48h后α-MSH+谷氨酸刺激組GFAP mRNA水平較單純谷氨酸刺激組顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),但與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);eNOS、nNOS、iNOSmRNA水平在單純谷氨酸處理和α-MSH+谷氨酸刺激組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。體內(nèi)試驗(yàn):1.谷氨酸注射處理48h后ERG結(jié)果顯示:谷氨酸組、α-MSH+谷氨酸組明視ERG的a波潛伏期比正常組縮短(P0.01),而谷氨酸組和α-MSH+谷氨酸組之間明視ERG a波潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。谷氨酸組明視ERG a波振幅與正常組相比明顯下降(P=0.000),而α-MSH的加入能部分阻止明視ERG a波振幅的下降(P0.01)。明視30Hz閃爍光a波振幅谷氨酸組低于正常組(P0.05),而加入α-MSH后,α-MSH+谷氨酸組與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.HE染色顯示各組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰,排列整齊,未見視網(wǎng)膜出血、水腫、萎縮及脫離。3.TUNEL染色顯示各組凋亡細(xì)胞總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.028,P=0.000)。α-MSH+谷氨酸組凋亡細(xì)胞數(shù)量均明顯少于谷氨酸組,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);α-MSH+谷氨酸組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)量與正常組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.061)。結(jié)論α-MSH可以在體外、體內(nèi)減輕谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性對視網(wǎng)膜引起的組織損傷、細(xì)胞凋亡和功能損害,這種保護(hù)作用可能是通過抑制氮氧化物的產(chǎn)生和膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生而實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：α-黑素細(xì)胞刺激素 視網(wǎng)膜 谷氨酸 興奮性毒性
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R774
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-14
• 前言14-16
• 研究現(xiàn)狀、成果14-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、體外實(shí)驗(yàn)16-34
• 1.1 對象和方法16-25
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物16
• 1.1.2 主要儀器、材料及試劑16-17
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法17-25
• 1.1.3.1 雞胚視網(wǎng)膜組織塊體外培養(yǎng)的建立與體內(nèi)視網(wǎng)膜的培養(yǎng)17-18
• 1.1.3.2 雞胚視網(wǎng)膜組織體外培養(yǎng)與體內(nèi)發(fā)育的形態(tài)觀察18-19
• 1.1.3.4 體外谷氨酸誘導(dǎo)視網(wǎng)膜興奮性毒性19-20
• 1.1.3.5 CCK-8檢測視網(wǎng)膜組織塊培養(yǎng)基中LDH活性20
• 1.1.3.6 TUNEL染色檢測視網(wǎng)膜組織塊各層細(xì)胞凋亡20-21
• 1.1.3.7 RT-PCR檢測視網(wǎng)膜組織塊NOS、GFAP的基因表達(dá)21-25
• 1.2 結(jié)果25-30
• 1.2.1 雞胚視網(wǎng)膜組織塊體外培養(yǎng)和相應(yīng)胚胎發(fā)育階段的形態(tài)25-26
• 1.2.2 視網(wǎng)膜組織塊培養(yǎng)基中LDH活性26-27
• 1.2.3 視網(wǎng)膜組織塊各層細(xì)胞凋亡27-29
• 1.2.4 視網(wǎng)膜組織塊NOS、GFAP基因表達(dá)29-30
• 1.3 討論30-33
• 1.3.1 雞胚視網(wǎng)膜組織塊培養(yǎng)體系對于完成本研究體外實(shí)驗(yàn)的可行性30-31
• 1.3.2 α-MSH在體外對谷氨酸誘導(dǎo)興奮性毒性的保護(hù)作用及機(jī)制探討31-33
• 1.4 小結(jié)33-34
• 二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)34-40
• 2.1 對象和方法34-36
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物34
• 2.1.2 主要儀器、材料及試劑34
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 2.1.3.1 體內(nèi)谷氨酸誘導(dǎo)視網(wǎng)膜興奮性毒性34-35
• 2.1.3.2 ERG檢測體內(nèi)視網(wǎng)膜功能35
• 2.1.3.3 HE染色觀察體內(nèi)視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)改變35
• 2.1.3.4 TUNEL染色檢測體內(nèi)視網(wǎng)膜各層細(xì)胞凋亡35
• 2.1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理35-36
• 2.2 結(jié)果36-39
• 2.2.1 體內(nèi)視網(wǎng)膜功能變化36
• 2.2.2 體內(nèi)視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)變化36-37
• 2.2.3 體內(nèi)視網(wǎng)膜各層細(xì)胞凋亡37-39
• 2.3 討論39
• 2.3.1 α-MSH在體內(nèi)對視網(wǎng)膜功能及細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用39
• 2.4 小結(jié)39-40
• 全文結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-44
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明44-45
• 綜述 縫隙連接在視網(wǎng)膜中的生理功能和視網(wǎng)膜疾病中的作用45-56
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 致謝56

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本文編號：998649