本文關(guān)鍵詞：LMP1瞬時(shí)過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞遷移的影響及其作用機(jī)制的探討

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【摘要】：目的:鼻咽癌是我國(guó)南方高發(fā)惡性腫瘤，EB病毒感染幾乎與所有未分化和低分化鼻咽癌都有關(guān)，EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1(latent membraneprotein1，LMP1)是近年研究病毒在人類(lèi)致癌作用中受到關(guān)注的蛋白。LMP1蛋白可控制細(xì)胞的增殖和凋亡，使上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響，但其相關(guān)的信號(hào)通路較為復(fù)雜，具體機(jī)制尚不明了。本研究構(gòu)建可在真核細(xì)胞中表達(dá)LMP1的增強(qiáng)熒光表達(dá)載體，觀察其在鼻咽癌細(xì)胞CNE2中的表達(dá)，探討潛伏膜蛋白LMP1瞬時(shí)過(guò)表達(dá)對(duì)CNE2細(xì)胞遷移的影響及其作用機(jī)制，以期為豐富鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:根據(jù)GenBank中LMP1基因mRNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)合成引物，Trizol法提取人鼻咽癌細(xì)胞株C15的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的片段。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后分離，切膠回收純化，獲得LMP1基因片段。LMP1基因片段經(jīng)雙酶切亞克隆到pEGFP-C1質(zhì)粒載體，構(gòu)建pEGFP-C1-LMP1真核表達(dá)載體。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將pEGFP-C1-LMP1體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中LMP1蛋白的表達(dá)情況及其在細(xì)胞內(nèi)定位。CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-LMP1后鼻咽癌CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)活力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。Transwell小室觀測(cè)轉(zhuǎn)染后CNE2細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)LMP1及細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)相關(guān)因子Rac1mRNA和蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果:重組載體經(jīng)Sal和BglⅡ雙酶切后，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)一條與理論預(yù)測(cè)值（1170bp）一致的目的條帶。DNA序列鑒定證實(shí)插入片段與GenBank提供的序列一致。將pEGFP-C1-LMP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株CNE2后，激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)GFP對(duì)照組綠色熒光蛋白廣泛分布在胞漿中，而GFP-LMP1主要定位于CNE2細(xì)胞的胞膜和部分胞漿中。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，與GFP對(duì)照組相比，pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力增強(qiáng)（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示：pEGFP-C1-LMP1組與GFP對(duì)照組相比，在G1、S期細(xì)胞數(shù)有差異（P＜0.05）。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)GFP對(duì)照組和pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組所測(cè)OD值分別為:0.1160±0.009，0.066±0.0097，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。在遷移實(shí)驗(yàn)中，GFP對(duì)照組和pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組發(fā)生遷移的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為:99.3±13.05和63.0±8.54，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Real-time PCR顯示：和GFP組相比， pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組LMP1mRNA的表達(dá)量明顯增高，Rac1mRNA表達(dá)降低；PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，在導(dǎo)入LMP1的CNE2細(xì)胞中可見(jiàn)一明顯條帶，而GFP組未見(jiàn)，Rac1mRNA在pEGFP-C1-LMP1轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)較GFP組明顯減弱。免疫印跡顯示LMP1蛋白的表達(dá)在GFP對(duì)照組呈陰性,而在目的基因轉(zhuǎn)染組呈陽(yáng)性；目的基因轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后24h可檢測(cè)到LMP1的表達(dá)，48h表達(dá)升高，72h后表達(dá)略為減弱，而Rac1則在目的基因轉(zhuǎn)染后的48h和72h表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)。 結(jié)論：成功構(gòu)建pEGFP-C1-LMP1真核表達(dá)載體，并在LMP1陰性的人類(lèi)低分化鼻咽癌CNE2細(xì)胞株中表達(dá)。LMP1瞬時(shí)過(guò)表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE2的侵襲和遷移，可能與Rac1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：LMP1 鼻咽腫瘤 真核表達(dá)載體 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 腫瘤遷移 rac1GTP結(jié)合蛋白質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 英漢縮略詞對(duì)照表10-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-45
• 2 結(jié)果45-53
• 3 討論53-61
• 4 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄65-66
• 致謝66-67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

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本文編號(hào)：987315