本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化角膜內(nèi)皮細(xì)胞可行性的研究

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【摘要】：目的：通過體外培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrowmesenchymal stem cells,rBMSCs)，掌握其細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，，并利用體外定向誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜內(nèi)皮細(xì)胞分化，檢測(cè)神經(jīng)元特性烯醇化酶（neuronspecific enolase,NSE）、Na+-K+-ATP酶活性蛋白的表達(dá)，檢測(cè)對(duì)流式抗體CD31和CD34的表達(dá)，探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的可行性。 方法： 1.選取大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的SD大鼠，利用Percoll分離液分離出rBMSCs并體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，觀察其形態(tài)，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD105、CD44、CD34抗體對(duì)rBMSCs進(jìn)行鑒定。 2.將rBMSCs按照2×105/ml密度種植在12孔板內(nèi)，分誘導(dǎo)組和空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)，3d后鋪滿瓶底約80%左右,將含有表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growthfactor, EGF）10ng/ml、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）30ng/ml等誘導(dǎo)劑加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，2d換一次液，誘導(dǎo)周期為3周。 3.3周后利用免疫熒光法檢測(cè)誘導(dǎo)后rBMSCs的Na+-K+-ATP酶的活性表達(dá)，免疫組化檢測(cè)方法檢測(cè)NSE的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、CD34的表達(dá)。 結(jié)果： 1.分離后的rBMSCs呈漩渦狀排列，中央細(xì)胞呈三角形及短梭形；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，其表面抗原CD29、CD105、CD44的表達(dá)率分別為：85.0%，90.5%，90.7%；CD34抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性表達(dá)率為：1.2%，成功分離并培養(yǎng)rBMSCs； 2.顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后2周的rBMSCs部分細(xì)胞呈多邊形具有內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)特征，3周后rBMSCs呈“鋪路石子”狀，多為六邊形。同時(shí)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示誘導(dǎo)組CD31陽(yáng)性率為(10.48±0.19）%，細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)表達(dá)的陽(yáng)性率為（16.71±1.85）%，胞漿見棕黃色粗大顆粒，染色陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)集中在細(xì)胞核部位；空白對(duì)照組均不表達(dá)CD31及NSE，誘導(dǎo)組與空白組比較差異有顯著性（X2=23.17， p0.05）；誘導(dǎo)組Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定結(jié)果為(0.231±0.107)U/mgprot，空白對(duì)照組對(duì)Na+-K+-ATP酶無活性，誘導(dǎo)組與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=41.67，p 0.01）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)組CD31和CD34表面抗原檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)率分別為：85.6%，92.4%；空白組CD31和CD34表面抗原檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)率分別為：1.2%，1.4%。 結(jié)論：體外成功分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向角膜內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能，經(jīng)誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可表達(dá)NSE、Na+-K+-ATP酶活性和流式抗體CD31、CD34的表達(dá)均陽(yáng)性；誘導(dǎo)分化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可作為種子細(xì)胞，使臨床移植角膜內(nèi)皮細(xì)胞成為可能。
【關(guān)鍵詞】：角膜內(nèi)皮細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 分化 大鼠
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R772.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-11
• 材料和方法11-17
• 1. 材料11-13
• 2. 方法13-16
• 3. rBMSCs 向 CECs 的誘導(dǎo)分化16
• 4. 誘導(dǎo)分化后 rBMSCs 的細(xì)胞鑒定16-17
• 結(jié)果17-22
• 1. 大鼠 MSCs 細(xì)胞形態(tài)學(xué)17-18
• 2. 大鼠 MSCs 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖18-19
• 3. 大鼠 MSCs 細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)果19
• 4. 誘導(dǎo)分化后 MSCs 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及相關(guān)檢測(cè)19-22
• 討論22-27
• 結(jié)論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-31
• 文獻(xiàn)綜述31-41
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 致謝41-42

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：975860