本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向誘導(dǎo)分化角膜內(nèi)皮細胞可行性的研究

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【摘要】：目的：通過體外培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rat bone marrowmesenchymal stem cells,rBMSCs)，掌握其細胞的生長特性，，并利用體外定向誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向角膜內(nèi)皮細胞分化，檢測神經(jīng)元特性烯醇化酶（neuronspecific enolase,NSE）、Na+-K+-ATP酶活性蛋白的表達，檢測對流式抗體CD31和CD34的表達，探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)向角膜內(nèi)皮樣細胞分化的可行性。 方法： 1.選取大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗室的SD大鼠，利用Percoll分離液分離出rBMSCs并體外培養(yǎng)、擴增，觀察其形態(tài)，通過流式細胞儀檢測CD29、CD105、CD44、CD34抗體對rBMSCs進行鑒定。 2.將rBMSCs按照2×105/ml密度種植在12孔板內(nèi)，分誘導(dǎo)組和空白對照組進行對比培養(yǎng)，3d后鋪滿瓶底約80%左右,將含有表皮生長因子（epidermal growthfactor, EGF）10ng/ml、成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）30ng/ml等誘導(dǎo)劑加入到培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，2d換一次液，誘導(dǎo)周期為3周。 3.3周后利用免疫熒光法檢測誘導(dǎo)后rBMSCs的Na+-K+-ATP酶的活性表達，免疫組化檢測方法檢測NSE的表達，流式細胞儀檢測內(nèi)皮細胞標(biāo)志物CD31、CD34的表達。 結(jié)果： 1.分離后的rBMSCs呈漩渦狀排列，中央細胞呈三角形及短梭形；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，其表面抗原CD29、CD105、CD44的表達率分別為：85.0%，90.5%，90.7%；CD34抗體檢測結(jié)果顯示，陽性表達率為：1.2%，成功分離并培養(yǎng)rBMSCs； 2.顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后2周的rBMSCs部分細胞呈多邊形具有內(nèi)皮細胞形態(tài)特征，3周后rBMSCs呈“鋪路石子”狀，多為六邊形。同時免疫熒光染色實驗顯示誘導(dǎo)組CD31陽性率為(10.48±0.19）%，細胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)表達的陽性率為（16.71±1.85）%，胞漿見棕黃色粗大顆粒，染色陽性，陽性反應(yīng)集中在細胞核部位；空白對照組均不表達CD31及NSE，誘導(dǎo)組與空白組比較差異有顯著性（X2=23.17， p0.05）；誘導(dǎo)組Na+-K+-ATP酶活性測定結(jié)果為(0.231±0.107)U/mgprot，空白對照組對Na+-K+-ATP酶無活性，誘導(dǎo)組與空白組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=41.67，p 0.01）。流式細胞儀檢測誘導(dǎo)組CD31和CD34表面抗原檢測陽性表達率分別為：85.6%，92.4%；空白組CD31和CD34表面抗原檢測陽性表達率分別為：1.2%，1.4%。 結(jié)論：體外成功分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞；大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞具有向角膜內(nèi)皮細胞分化的潛能，經(jīng)誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細胞可表達NSE、Na+-K+-ATP酶活性和流式抗體CD31、CD34的表達均陽性；誘導(dǎo)分化后的骨髓間充質(zhì)干細胞可作為種子細胞，使臨床移植角膜內(nèi)皮細胞成為可能。
【關(guān)鍵詞】：角膜內(nèi)皮細胞 骨髓間充質(zhì)干細胞 分化 大鼠
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R772.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-11
• 材料和方法11-17
• 1. 材料11-13
• 2. 方法13-16
• 3. rBMSCs 向 CECs 的誘導(dǎo)分化16
• 4. 誘導(dǎo)分化后 rBMSCs 的細胞鑒定16-17
• 結(jié)果17-22
• 1. 大鼠 MSCs 細胞形態(tài)學(xué)17-18
• 2. 大鼠 MSCs 細胞生長曲線圖18-19
• 3. 大鼠 MSCs 細胞表面標(biāo)記物檢測結(jié)果19
• 4. 誘導(dǎo)分化后 MSCs 細胞形態(tài)學(xué)變化及相關(guān)檢測19-22
• 討論22-27
• 結(jié)論27-28
• 參考文獻28-31
• 文獻綜述31-41
• 參考文獻38-41
• 致謝41-42

【參考文獻】

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本文編號：975860