本文關鍵詞：EBV潛伏膜蛋白2A的表達、鑒定和其全人源單克隆抗體篩選生物學特性分析

  更多相關文章： 噬菌體展示 人源抗體 潛伏膜蛋白2A 鼻咽癌

【摘要】：鼻咽癌是來源于鼻咽上皮的高度惡性腫瘤,腫瘤進展極易侵犯顱底等重要結構,并較早發(fā)生頸部淋巴結轉移和遠處轉移。鼻咽癌表現(xiàn)為種族和地區(qū)分布的特點,是我國十大高發(fā)惡性腫瘤之一,其發(fā)病率為20/100,000,已引發(fā)嚴重健康問題。鼻咽癌是由Epstein-Barr病毒(EBV)的潛伏感染、環(huán)境因素和宿主的基因遺傳因素共同參與的多步驟交互作用而逐步形成的復雜性疾病。幾乎所有的鼻咽癌細胞都含有EBV基因組,并表達EBNA1,EBER1,EBER2,和LMP1,LMP2A,LMP2B,這使得這些病毒蛋白成為理想的腫瘤標志物,其中LMP2A(latent membrane protein2A,LMP2A)在鼻咽上皮細胞的轉化和癌變過程中的作用倍受關注,是目前公認的病毒癌基因之一。它參與了鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展,以LMP2A為靶標,設計并制備各種具有中和作用或靶向功能的抗體將會為鼻咽癌的診斷和靶向治療提供新的方法。本研究擬以基因工程技術設計并表達LMP2A的表位融合蛋白LMP25,分析其免疫原性,利用純化的LMP25蛋白和鼻咽癌細胞(SUNE、CNE)通過全人源噬菌體抗體展示技術篩選人源抗LMP2A胞外區(qū)抗體Fab(命名為Fab29),對篩選獲得的Fab29進行表達、純化以及功能鑒定。方法1.表位融合蛋白的設計及表達載體的構建:根據(jù)Genebank中的LMP2A基因序列和文獻報道,選擇LMP2A的表位基因序列。LMP2A第二胞外區(qū)基因為:TGTCTGACGTGGCGTATTGAAGACCCGCCGTTTAACAGCCTGCTGTTTGCCCTGC TGGCAGCAGCCGGT,LMP2A第五胞外區(qū)基因為:GGCGGCAGCATTCTGCAAACCA ACTTCAAAAGCCTGAGCAGCACCGAATTCATCCCGAACCTGTTT。優(yōu)化表位融合蛋白的基因序列,設計LMP2A第二、五胞外區(qū)重復串聯(lián)基因,分別在5’端和3’端設置酶切位點Bam HI和Xho I,克隆于p ET28a表達載體中,構建LMP2A的表位融合蛋白的表達載體。2.表位融合蛋白LMP2A的表達和純化:重組表達載體經測序確認正確后轉化至大腸桿菌BL21,選擇單克隆菌落,擴大培養(yǎng)并誘導表達。表達產物經8M尿素變性后Ni-NTA層析柱純化,復性后Coomassie brilliant blue染色后檢測蛋白純度。3.重組表位融合蛋白的鑒定:Western blot鑒定純化的重組LMP2A表位融合蛋白。用純化LMP2A重組表位融合蛋白作為抗原免疫小鼠。ELISA檢測小鼠抗血清效價后并用免疫組織化學分析該小鼠多抗的特異性和抗原的免疫源性。4.抗體的篩選:利用鼻咽癌細胞(SUNE,CNE)與純化抗原LMP25(已證明有免疫原性的LMP2A融合蛋白)采用差減篩選和固相篩選相結合的方法進行篩選人源噬菌體抗體庫(Fab抗體庫)。第1、3、5輪通過細胞的差減篩選,第2、4、6輪通過固相篩選。其中,細胞差減篩選以鼻咽癌細胞CNE為陰性細胞,鼻咽癌細胞SUNE為陽性細胞;固相篩選以包被LMP2A融合蛋白為篩選抗原。篩選6輪后經噬菌體酶聯(lián)免疫吸附反應(phage enzyme linked immunosorbent assay,phage ELISA)進行陽性克隆鑒定。5.Fab29抗體的原核表達的鑒定和純化:Fab29噬菌體感染大腸桿菌Top 10F’,培養(yǎng)細菌至對數(shù)生長期,IPTG誘導表達;表達蛋白產物使用Protein L親和層析柱純化。6.純化Fab29的生物特性分析:純化產物經ELISA、流式細胞技術、免疫共沉淀、免疫熒光、親和力測試和免疫組化技術進行該抗體的特異性、結合率和親和力的測試。結果1.經核酸序列分析證實,LMP2A第二、五胞外區(qū)重復串聯(lián)基因與設計的目的蛋白序列一致,并克隆于p ET28a表達載體中誘導表達。2.誘導結果經SDS-PAGE檢測顯示:質粒在大腸桿菌中能順利表達,而且產量較高。通過蛋白變性His親和層析純化,復性后再經SDS-PAGE鑒定,純化后的重組蛋白純度較高。3.純化后蛋白經Western blot檢測結果顯示,其能夠被大鼠抗LMP2A抗體所捕獲。用此蛋白免疫小鼠產生的多克隆抗體,經間接ELISA分析,檢測結果與抗體濃度相關,當抗體濃度稀釋至1:256000時,其OD450值小于0.2,其效價達1:256000。免疫組織化學分析結果顯示,該抗體具有商業(yè)化大鼠抗LMP2A抗體相同的特性,能夠識別鼻咽癌患者腫瘤切片中的LMP2A蛋白。4.基因測序顯示篩選獲得29號Fab抗體基因序列輕鏈為κ鏈,重鏈為λ鏈。5.Fab29在原核表達系統(tǒng)內能夠表達并正確組裝;使用Protein L親和層析柱純化獲得了純度較高的可溶性抗體Fab29。6.ELISA結果示在Fab29濃度為50μg/ml的時候0D450的值能達到1.613;流式細胞技術提示Fab29與SUNE細胞的結合率高達96.89%;免疫共沉淀提示Fab29所捕獲的蛋白就是LMP2A蛋白;免疫熒光結果示Fab29定位于細胞的表面;親和力檢測結果顯示Fab29與融合蛋白的親和力達到1.79×10-9;免疫組化的結果顯示Fab29能夠與LMP2A表達陽性的鼻咽癌患者的腫瘤細胞結合。結論1.本實驗證明了通過基因工程技術設計的LMP2A胞外區(qū)LMP25重復串聯(lián)載體能夠在原核表達系統(tǒng)中表達的可能性。純化出可溶性的LMP25蛋白能夠免疫小鼠獲得高親和力的多克隆抗體,免疫組化的結果說明LMP25具有較高的穩(wěn)定性和免疫源性,能夠代表LMP2A蛋白用于人源抗LMP2A抗體的篩選。2.通過全人源抗體庫,采用差減篩選法和固相篩選法可以獲得高親和力的抗LMP2A胞外區(qū)抗體Fab29。3.Fab29可以在原核表達系統(tǒng)中表達并組裝具有生物活性的可溶性LMP2A胞外區(qū)特異性抗體。ELISA、細胞流式、免疫共沉淀、免疫熒光、親和力測試以及免疫組化都說明了Fab29具有與天然構象的LMP2A特性結合的能力且親和力較高�？傊�,本研究制備了LMP2A的重組融合蛋白(LMP25)且其能很好的代表LMP2A蛋白的免疫源性并利用LMP25和鼻咽癌細胞篩選出全人源抗LMP2A的Fab29單克隆抗體。通過一系列的生物學鑒定試驗證明了該單克隆抗體能夠特異性與天然構象的LMP2A蛋白結合。該抗體可用于對LMP2A蛋白的生物學研究。在腫瘤研究中意義更大,以該項技術制得的抗體可以作為載體分子進行腫瘤影像學診斷及免疫治療。
【關鍵詞】：噬菌體展示 人源抗體 潛伏膜蛋白2A 鼻咽癌
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 前言14-17
• 研究一 EBV編碼潛伏膜蛋白2A抗原表位的串聯(lián)表達及其免疫原性分析17-31
• 材料與方法17-26
• 結果26-29
• 討論29-31
• 研究二 人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區(qū)抗體Fab29的篩選、鑒定31-46
• 材料與方法31-40
• 結果40-43
• 討論43-46
• 研究三 人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區(qū)抗體Fab29的表達、純化與功能分析46-61
• 材料與方法46-53
• 結果53-58
• 討論58-61
• 討論61-63
• 參考文獻63-68
• 附錄1 EBV編碼的潛在膜蛋白2A在鼻咽癌發(fā)病機制中的作用68-74
• 參考文獻72-74
• 附錄2 縮略語74-75
• 附錄3 在讀期間參與的工作75-77
• 致謝77

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李智,林素暇,梁英杰;巨噬細胞移動抑制因子提高鼻咽癌細胞體外侵襲能力[J];中華病理學雜志;2004年01期

2 張蕾,王曉華,馬秀蘭,何安光;EB病毒基因BARF1在鼻咽癌細胞中的表達及意義[J];中國癌癥雜志;2004年01期

3 王安宇;鼻咽癌細胞生物節(jié)律基礎研究和臨床時辰治療現(xiàn)狀[J];廣西醫(yī)學;2005年06期

4 吳敬波;崔艷慧;張建文;范娟;文慶蓮;;心肌細胞培養(yǎng)液對鼻咽癌細胞生長的體外抑制作用實驗研究[J];四川腫瘤防治;2006年02期

5 姚輝璐;朱淼;王桂文;彭立新;何碧娟;何敏;黎永青;;單個鼻咽癌細胞的拉曼光譜分析的研究[J];光譜學與光譜分析;2007年09期

6 杜玲艷;黃丹;詹旭;;鼻咽癌細胞后向偏振散射光譜研究[J];四川理工學院學報(自然科學版);2009年03期

7 蘇欣;李仕晟;康競;謝yN;江靜;;靶向阻斷表皮生長因子受體信號通路影響鼻咽癌細胞生長的研究[J];實用醫(yī)學雜志;2009年18期

8 易翔;唐安洲;覃穎;溫文勝;謝瑩;;一氧化氮對鼻咽癌細胞生長及血管內皮生長因子的調節(jié)作用[J];中國癌癥防治雜志;2009年03期

9 陳蔚;崔英;岳惠芬;梁新強;;新城疫病毒抑制鼻咽癌細胞的體外實驗研究[J];中華腫瘤防治雜志;2010年01期

10 何曉松;易世江;凌月福;;表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過下調誘導型一氧化氮合酶促進鼻咽癌細胞的凋亡[J];廣東醫(yī)學;2010年14期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳陽;李永增;陳榮;;鼻咽癌細胞的拉曼光譜[A];中國遺傳學會第十屆全國激光生物學學術會議論文摘要集[C];2009年

2 焦偉;莫祥蘭;;腫瘤壞死因子聯(lián)合白介素2抗鼻咽癌細胞實驗研究[A];2000全國腫瘤學術大會論文集[C];2000年

3 姚輝璐;王桂文;何敏;蔣玉艷;黎永青;;單細胞拉曼光譜分析鼻咽癌細胞的研究[A];第六屆全國光生物學學術研討會論文集[C];2004年

4 李步洪;林慧韞;謝樹森;;鼻咽癌細胞的熒光光譜特性[A];大珩先生九十華誕文集暨中國光學學會2004年學術大會論文集[C];2004年

5 姚輝璐;王桂文;彭立新;黎永青;;單個鼻咽癌細胞的拉曼光譜分析的研究[A];中國光學學會2006年學術大會論文摘要集[C];2006年

6 王瓊;伍鋼;;血管緊張素Ⅱ及其受體阻滯劑與放療聯(lián)合對鼻咽癌細胞的作用及其機制的研究[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術年會論文集[C];2007年

7 高健赫;蔡紅星;張喜和;;鼻咽癌細胞分泌物的拉曼光譜研究[A];第十六屆全國光散射學術會議論文摘要集[C];2011年

8 冼勵堅;孫健;曹棄元;葉燕麗;;鼻咽癌細胞DNA合成的時間節(jié)律研究[A];2000全國腫瘤學術大會論文集[C];2000年

9 吳敬波;崔艷慧;張建文;范娟;文慶蓮;;心肌細胞培養(yǎng)液對鼻咽癌細胞生長抑制作用體外實驗研究[A];第九屆全國腫瘤生物治療學術會議論文集[C];2006年

10 張配;趙素容;宋樂樂;浦龍健;蔣志文;劉浩;蔣琛琛;;低分子量肝素聯(lián)合紫杉醇對鼻咽癌細胞侵襲和遷移能力的影響[A];促進科技經濟結合，，服務創(chuàng)新驅動發(fā)展——蚌埠市科協(xié)2012年度學術年會論文集[C];2012年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 裴娜娜;Ang-(1-7)過表達對鼻咽癌細胞體內外生長的影響[D];南方醫(yī)科大學;2015年

2 李國萍;不同侵襲遷移能力鼻咽癌細胞蛋白組學及轉移相關基因功能研究[D];昆明醫(yī)科大學;2012年

3 苗北平;辣根過氧化物酶/吲哚三醋酸酶前藥對鼻咽癌細胞的殺傷作用[D];山東大學;2008年

4 徐娟;EB病毒LMP1通過轉錄因子EGFR調節(jié)酪氨酰蛋白硫酸轉移酶TPST-1介導趨化因子受體CXCR4活性的分子機制[D];中南大學;2010年

5 吳平;ARC基因在鼻咽癌中的表達及與鼻咽癌細胞放化療敏感性的研究[D];中南大學;2012年

6 張荔茗;鼻咽癌細胞中“c-Myc/miRNA/靶基因”交互作用分子網(wǎng)絡的初步構建及功能研究[D];中南大學;2009年

7 謝李;HSP70調控雷帕霉素對鼻咽癌細胞生長抑制作用分子機制研究[D];中南大學;2010年

8 王瓊;放射線對小鼠組織線粒體基因和鼻咽癌細胞生物學行為影響的初步研究[D];華中科技大學;2010年

9 孫懿;應用RNA干擾和蛋白質組學技術研究鼻咽癌細胞中p53的功能[D];中南大學;2007年

10 袁智勇;紫杉醇對鼻咽癌細胞放射增敏作用的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2005年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 夏玉對;Garcinone抑制鼻咽癌細胞生長及作用機制的體外研究[D];廣西醫(yī)科大學;2015年

2 陳志;EBV-LMP2A誘導鼻咽癌細胞EMT和對其生物學特性的影響[D];南京醫(yī)科大學;2015年

3 王惠潔;間質蛋白Periostin對鼻咽癌細胞侵襲遷移能力的影響[D];南華大學;2015年

4 黃s

本文編號：972123