本文關(guān)鍵詞：SMAC基因干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)

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【摘要】：白內(nèi)障是世界范圍主要的致盲眼病,據(jù)預(yù)測(cè)到2020年每年會(huì)有2000-2500萬患者需行白內(nèi)障手術(shù)。這無疑會(huì)對(duì)社會(huì)和國(guó)家造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,探求白內(nèi)障的發(fā)病因素及發(fā)病機(jī)理,延緩和阻止白內(nèi)障發(fā)生及發(fā)展顯得尤為重要。國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者尤其是眼科工作者為此做出了巨大的努力,并取得了令人矚目的成績(jī)。近年來越來越多的證據(jù)表明晶狀體上皮細(xì)胞(Lens epithelial cells,LECs)凋亡可能是各種非先天性白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。因此,檢測(cè)年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生的分子機(jī)制,抑制晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡過程,為延緩和阻止年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展提供了新的思路。 線粒體蛋白Smac/DIABLO(second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low PI),被稱為第二線粒體來源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活劑,是一種存在于線粒體并且調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)。既往研究顯示在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中Smac可能參與了晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡過程以及白內(nèi)障的形成。因此,如果能特異性沉默Smac基因,觀察其下調(diào)前后晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)凋亡的變化,對(duì)白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在生物體內(nèi),內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA(double. stranded RNA, dsRNA)引起與其同源的mRNA特異性降解,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默。dsRNA經(jīng)酶切后會(huì)形成很多小片段siRNA (Small interfering RNA,siRNA),這些小片段siRNA是一種小RNA分子,一旦與信使RNA(mRNA)中的互補(bǔ)序列互相結(jié)合,會(huì)導(dǎo)致整條mRNA失去翻譯成蛋白質(zhì)的功能,RNA干擾技術(shù)是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具,能夠高效、特異的使靶基因沉默。本實(shí)驗(yàn)擬使用RNA干擾技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)Smac基因的特異性沉默,為進(jìn)一步探索凋亡與白內(nèi)障形成之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 研究目的 構(gòu)建針對(duì)Smac基因帶有篩選標(biāo)記的siRNA慢病毒載體并測(cè)定目的基因在晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況,為利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)探討白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞凋亡的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 方法 1.永生化人晶狀體上皮細(xì)胞(HLE-B3)的培養(yǎng)：將凍存的晶狀體上皮細(xì)胞復(fù)蘇后,放入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取融合至90%的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2.構(gòu)建針對(duì)Smac的慢病毒載體,用于病毒的生產(chǎn)。 3.設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA組,進(jìn)行相應(yīng)病毒感染,病毒感染細(xì)胞16h后換液,并在72h后熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)。 4.慢病毒感染細(xì)胞96h后提取細(xì)胞中的總RNA,做三次重復(fù)的實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)。實(shí)驗(yàn)中我們采用家族管理基因GAPDH作為內(nèi)參基因。 結(jié)果 (1)綠色熒光蛋白(GFP)在人晶狀體上皮細(xì)胞中成功表達(dá),在熒光顯微鏡下觀察,熒光表達(dá)明亮均勻,無明顯細(xì)胞毒性,對(duì)感染72小時(shí)后的細(xì)胞照相,發(fā)現(xiàn)每一組的感染率都在80%左右。 (2) RT-PCR檢測(cè)Smac基因mRNA水平在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)siRNA組mRNA的量與陰性對(duì)照組比較顯著下調(diào),敲減效率達(dá)66.5%。(P0.05)。 結(jié)論 成功構(gòu)建了慢病毒載體結(jié)構(gòu)來表達(dá)siRNA以達(dá)到對(duì)Smac基因的沉默,為進(jìn)一步研究白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理與細(xì)胞凋亡的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：晶狀體上皮細(xì)胞 RNA干擾 Smac 報(bào)告基因
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R776.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 中英文縮略詞表11-12
• 前言12-32
• 1 材料與儀器15-17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-21
• 3 結(jié)果21-22
• 4 討論22-27
• 5 結(jié)論27-28
• 6 附圖28-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 綜述部分34-55
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及在校期間發(fā)表的文章55-56
• 致謝56

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1 張曉紅,孫慧敏,陳桂彬,苑曉勇,袁佳琴;腫瘤壞死因子對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的粘附移行作用[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2000年12期

2 彭惠,李平華;細(xì)胞因子與晶狀體上皮細(xì)胞[J];眼科新進(jìn)展;2001年01期

3 王冰,翁景寧;腺病毒載體介導(dǎo)的單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷體系對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的作用[J];中華眼科雜志;2002年10期

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