發(fā)布時(shí)間：2017-10-03 05:06

  本文關(guān)鍵詞：不同方法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠視網(wǎng)膜下的比較

  更多相關(guān)文章： 間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞移植 大鼠 視網(wǎng)膜下 分化

【摘要】：研究背景近年來(lái),視網(wǎng)膜變性疾病,包括年齡相關(guān)性黃斑變性,視網(wǎng)膜色素變性等,發(fā)病率逐漸升高,是主要的致盲性疾病。這些疾病都是以進(jìn)行性色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epitheium, RPE)、光感受器細(xì)胞的功能喪失,凋亡或壞死為特點(diǎn),造成視力不可逆的損害。 正常的RPE是具有極性的單層細(xì)胞,位于視網(wǎng)膜的最外層。它是代謝高度活躍的細(xì)胞層,主要支持感光細(xì)胞層。主要功能包括轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),視黃醇回收利用,產(chǎn)生色素以及吞噬視錐、視桿細(xì)胞外節(jié)。RPE在其細(xì)胞頂面分泌色素上皮衍生生長(zhǎng)因子(pigment epitheliumderived epitheliumderived growth factor, PEDF),基底側(cè)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)。每個(gè)細(xì)胞與Bruch膜緊密相連,相鄰細(xì)胞間的緊密聯(lián)系構(gòu)成了血視網(wǎng)膜屏障。 在濕性AMD中,由于RPE的功能失調(diào),屏障功能的損壞,異常的新生血管由脈絡(luò)膜發(fā)出,穿過(guò)玻璃膜和視網(wǎng)膜色素上皮到達(dá)視網(wǎng)膜下,形成脈絡(luò)膜新生血管,繼而引發(fā)出血及瘢痕的形成,破壞了正常的視網(wǎng)膜組織,引起視力的丟失。在干性AMD中,RPE的功能喪失、凋亡最終導(dǎo)致了黃斑部位光感受器的喪失,從而導(dǎo)致視力的缺損。雖然營(yíng)養(yǎng)及抗氧化的藥物治療,或在濕性AMD中,玻璃體內(nèi)注射抗VEGF因子能減緩疾病的進(jìn)展,但沒(méi)能替換掉RPE或感光細(xì)胞從而逆轉(zhuǎn)AMD病程。 鑒于病變的RPE是AMD主要的病變部位,通過(guò)手術(shù)的方式替換掉黃斑部的病變的RPE應(yīng)該有效。目前主要有黃斑轉(zhuǎn)位手術(shù)和RPE自體移植術(shù),前者是將黃斑區(qū)神經(jīng)視網(wǎng)膜層轉(zhuǎn)移到周邊健康的RPE區(qū)域,后者則是將外周相對(duì)健康的RPE-脈絡(luò)膜植片移植至黃斑區(qū),這兩種手術(shù)方式已在部分病例中被采用,在長(zhǎng)期的隨訪中均被證實(shí)可維持或提高患者的視力。然而上述兩種手術(shù)存在創(chuàng)傷大、操作復(fù)雜,并發(fā)癥多的缺點(diǎn),難于在臨床上推廣使用,另外,這些手術(shù)方法僅能對(duì)RPE的損害有效,對(duì)于黃斑光感受器嚴(yán)重受損的病例則難于發(fā)揮作用。因此尋找一種操作簡(jiǎn)單,便于推廣、創(chuàng)傷傷小的細(xì)胞替代方法越來(lái)越受到關(guān)注。 干細(xì)胞是一群具有自我更新及多向潛能的細(xì)胞群。利用干細(xì)胞的可塑性,定向分化為目的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植或利用干細(xì)胞的分泌細(xì)胞因子修復(fù)受損的視網(wǎng)膜及RPE,已經(jīng)成為視網(wǎng)膜變性疾病治療的研究熱點(diǎn)。干細(xì)胞研究主要分為兩大類,胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞分化潛能強(qiáng),可以向內(nèi),中,外三個(gè)胚層的組織分化。但是免疫排斥的問(wèn)題及倫理道德的問(wèn)題限制其廣泛的應(yīng)用。成體干細(xì)胞,也具有多向分化的潛能,取材容易,無(wú)倫理道德問(wèn)題,成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。 應(yīng)用于視網(wǎng)膜疾病治療實(shí)驗(yàn)研究的成體干細(xì)胞主要有：視網(wǎng)膜干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)腦源性干細(xì)胞等。相比于其他干細(xì)胞,BMSCs具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)BMSCs也具有向三個(gè)胚層的組織細(xì)胞分化的能力,如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等；2)取材容易,易于擴(kuò)增,無(wú)倫理道德的問(wèn)題；3)具有強(qiáng)大的旁分泌作用,分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子促進(jìn)損傷組織的修復(fù)；4)具有免疫調(diào)節(jié)及抑制炎癥因子釋放的作用,有利于同種異體的移植,減少免疫排斥藥物的使用；5)主動(dòng)向損傷組織區(qū)域遷移的作用；6)移植后無(wú)腫瘤形成的傾向。這些優(yōu)點(diǎn)使得BMSCs移植視網(wǎng)膜變性疾病治療研究中備受關(guān)注。 已經(jīng)有體外實(shí)驗(yàn)中表明,BMSCs在活化素A、�；撬岷捅砥どL(zhǎng)因子的誘導(dǎo)作用下能表達(dá)感光細(xì)胞特異性標(biāo)記物視紫質(zhì)、視蛋白等。將BMSCs視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后,可觀察至BMSCs向RPE分化,呈現(xiàn)出RPE的形態(tài),細(xì)胞內(nèi)具有顆粒,表達(dá)RPE的標(biāo)志物-細(xì)胞角蛋白表達(dá)。這些研究均提示,BMSCs在微環(huán)境的作用下有向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的潛能。如何將干細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下,并使其在視網(wǎng)膜下能維持更多地活細(xì)胞數(shù)量,并能在局部微環(huán)境作用下向REP或光感受器細(xì)胞分化,是細(xì)胞移植治療中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。目前文獻(xiàn)上報(bào)道細(xì)胞移植途徑主要有眼局部注射和全身靜脈注射兩大類。前者又包括視網(wǎng)膜下注射和玻璃體腔注射。這幾種移植方式各有優(yōu)缺點(diǎn).(1)視網(wǎng)膜下注射：直接把細(xì)胞注射移植到靶部位即RPE層與感光細(xì)胞層之間。盡管受到體積限制,單次注射的細(xì)胞數(shù)量偏少,但是所注射的細(xì)胞都能進(jìn)入視網(wǎng)膜下,只要有足夠的活細(xì)胞數(shù)量并在局部微環(huán)境的狀態(tài)下能向RPE及視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞分化,便有可能發(fā)揮細(xì)胞替代作用,因此應(yīng)是最理想的移植方法。不足之處在于視網(wǎng)膜下移植操作較復(fù)雜,會(huì)引起視網(wǎng)膜出血及視網(wǎng)膜脫離等損傷.(2)經(jīng)玻璃體腔注射移植：將細(xì)胞懸液注射到玻璃體腔中,較視網(wǎng)膜下注射操作相對(duì)簡(jiǎn)單,對(duì)視網(wǎng)膜造成的損傷較小。然而移植的干細(xì)胞需要通過(guò)玻璃體腔遷移到視網(wǎng)膜內(nèi)。由于內(nèi)界膜的阻礙,只有不到1%的細(xì)胞能到達(dá)視網(wǎng)膜內(nèi)。在不同的疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究中,細(xì)胞能否進(jìn)入視網(wǎng)膜下或在向視網(wǎng)膜下遷移的過(guò)程中分化情況,報(bào)道結(jié)果也各有不同。(3)靜脈注射：將細(xì)胞懸液注射到靜脈中,細(xì)胞通過(guò)體循環(huán)到達(dá)眼部,并遷移至視網(wǎng)膜下或視網(wǎng)膜內(nèi)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,便于反復(fù)注射,不受注射容積的限制,但是存在誘導(dǎo)血栓形成及過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)。最大的問(wèn)題在于,細(xì)胞經(jīng)過(guò)全身循環(huán)后能否到達(dá)視網(wǎng)膜附近存在爭(zhēng)議；有研究者認(rèn)為,體循環(huán)中的細(xì)胞難以通過(guò)血眼屏障,不能在靶位聚集足夠量的活細(xì)胞發(fā)揮作用；然而部分研究者提出在視網(wǎng)膜色素變性及AMD等病理狀態(tài)下,視網(wǎng)膜屏障功能并不完整,細(xì)胞可以到達(dá)視網(wǎng)膜下。通過(guò)改變干細(xì)胞表位抗原決定簇,使其對(duì)視網(wǎng)膜組織有特殊的親和力,可達(dá)到足夠多的活細(xì)胞量。本文旨在比較通過(guò)不同的方式將BMSCs移植到大鼠視網(wǎng)膜下,探索在不同方式下,BMSCs在眼部微環(huán)境的作用下的存活及分化情況,為BMSCs移植治療視網(wǎng)膜變性疾病的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的通過(guò)視網(wǎng)膜下注射、玻璃體腔注射將BMSCs移植到正常SD大鼠的眼內(nèi),尾靜脈注射將MSCs移植到大鼠體內(nèi),觀察MSCs通過(guò)這三種途徑細(xì)胞在正常大鼠的視網(wǎng)膜下及周圍的分布、存活和分化情況。 方法取3-4周齡的SD大鼠的骨髓,采用全骨髓貼壁篩選培養(yǎng)法分離、獲得正常SD大鼠的BMSCs,取第4代的培養(yǎng)的MSCs,經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞表面標(biāo)志物-CD29、CD44、CD45表達(dá)情況,證實(shí)本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞符合MSCs的特征后,采用攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的腺病毒感染BMSCs,使EGFP在MSCs內(nèi)表達(dá),從而獲得標(biāo)記。然后將EGFP標(biāo)記的MSCs,配制成5*104個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液,通過(guò)視網(wǎng)膜下注射、玻璃腔注射將細(xì)胞移植到正常SD大鼠的眼內(nèi),尾靜脈注射將MSCs移植到大鼠體內(nèi)。將51只正常6-SD大鼠分為視網(wǎng)膜下注射組(A組,15只),玻璃體腔注射組(B組,15只),尾靜脈注射組(C組,21只)。A組大鼠的右眼作為實(shí)驗(yàn)眼,用33G銳針頭在睫狀體平坦部刺入,換用34G鈍針頭到達(dá)視網(wǎng)膜下,向視網(wǎng)膜下腔內(nèi)注入2u1MSCs細(xì)胞懸液,共計(jì)1*105個(gè)細(xì)胞/眼,左眼作為對(duì)照眼,向視網(wǎng)膜下腔內(nèi)注入等量L-DMEM。B組大鼠的右眼作為實(shí)驗(yàn)眼,用33G銳針頭在睫狀體平坦部刺入,直接到達(dá)眼內(nèi),向玻璃體腔內(nèi)注入2ulMSCs細(xì)胞懸液,共計(jì)1*105個(gè)細(xì)胞/眼,左眼作為對(duì)照眼,玻璃體腔內(nèi)注入等量L-DMEM。若發(fā)生視網(wǎng)膜下大出血或玻璃體出血的大鼠棄去不用。C組中隨機(jī)取15只作為實(shí)驗(yàn)組通過(guò)尾靜脈注射1mlMSCs細(xì)胞懸液到大鼠體內(nèi),共計(jì)5*107個(gè)細(xì)胞/鼠,6只作為對(duì)照組注射等量生理鹽水。分別于術(shù)后3天、7天及21天處死一批大鼠,摘取大鼠的眼球,進(jìn)行連續(xù)冰凍切片,在熒光顯微鏡下直接觀察不同組的移植MSCs細(xì)胞在眼內(nèi)的分布情況,并用小鼠抗大鼠Rhodopsin單抗、小鼠抗大鼠RPE65(retinal pigment epithelium, RPE)單抗、兔抗大鼠的GFAP(glial fibrillary acidic protein, GFAP)單抗及Cy3標(biāo)記的二抗進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?觀察MSCs在眼內(nèi)的微環(huán)境中的存活、分化情況。 結(jié)果(1)采用全骨髓培養(yǎng)法分離獲得MSCs,細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD45為94.2%,98.9%、0.9%,符合MSCs鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。(2)MSCs經(jīng)EGFP-腺病毒轉(zhuǎn)染后,在熒光顯微鏡下觀察,發(fā)綠色熒光,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),EGFP陽(yáng)性的MSCs比例為73.66%。(3)在視網(wǎng)膜下移植的實(shí)驗(yàn)眼球切片中,可以見(jiàn)到大量MSCs細(xì)胞存活于視網(wǎng)膜下間隙內(nèi),術(shù)后21天時(shí),細(xì)胞仍然存活于移植部位,未見(jiàn)明顯向遠(yuǎn)處遷移,部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物,未見(jiàn)表達(dá)感光細(xì)胞、RPE、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等標(biāo)志物。在玻璃體腔移植的實(shí)驗(yàn)眼球切片中,可以見(jiàn)到MSCs細(xì)胞存活于玻璃體腔內(nèi),直至術(shù)后21天時(shí),細(xì)胞仍在玻璃體腔存活,未見(jiàn)細(xì)胞向視網(wǎng)膜內(nèi)遷移到達(dá)視網(wǎng)膜下區(qū)域,不表達(dá)感光細(xì)胞、RPE、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等標(biāo)志物。在尾靜脈移植的實(shí)驗(yàn)眼球切片中,未見(jiàn)有MSCs進(jìn)入視網(wǎng)膜下區(qū)域及眼內(nèi)。 結(jié)論通過(guò)視網(wǎng)膜下移植及玻璃腔移植均可以將MSCs移植于眼內(nèi),視網(wǎng)膜下移植的細(xì)胞可以達(dá)到視網(wǎng)膜下區(qū)域,細(xì)胞可以存活達(dá)3周,部分細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化,未見(jiàn)細(xì)胞向RPE及感光細(xì)胞分化。移植于玻璃體腔的細(xì)胞不能突破內(nèi)界膜遷移至視網(wǎng)膜下,未見(jiàn)細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化。尾靜脈注射的MSCs,未見(jiàn)透過(guò)血-眼屏障進(jìn)入視網(wǎng)膜下。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞移植 大鼠 視網(wǎng)膜下 分化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R774.1
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定15-29
• 1. 引言15
• 2. 材料15-17
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法17-18
• 4. 結(jié)果18-22
• 5. 討論22-29
• 第二章 不同方法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠視網(wǎng)膜下的比較29-56
• 1. 引言29
• 2. 材料29-32
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法32-39
• 4. 結(jié)果39-48
• 5. 討論48-55
• 6.結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 綜述60-76
• 參考文獻(xiàn)73-76
• 縮略詞對(duì)照表76-77
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文77-79
• 致謝79-80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 柯技;陳曉瑞;易少華;鄧偉連;王愛(ài)楓;馬科;邱照;王樹法;;大鼠視神經(jīng)挫傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)改變及GFAP表達(dá)的變化[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年03期

2 黃濤;徐如祥;姜曉丹;韓富;張志強(qiáng);謝才軍;杜謀選;鄒雨汐;;大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及其表面抗原的檢測(cè)[J];中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志;2008年02期

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本文編號(hào)：963292