本文關(guān)鍵詞：TGF-β受體抑制劑Compound C對hESC向RPE定向誘導效率的影響

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【摘要】：研究目的 應(yīng)用人胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cells, hESC)來源的視網(wǎng)膜色素上皮細胞(Retinal Pigment Epithelium, RPE)進行體內(nèi)細胞移植治療,為視網(wǎng)膜變性疾病患者重見光明帶來了希望。然而hESC向RPE細胞誘導分化效率低、成熟周期長、造價高仍然是目前研究的瓶頸。RPE由神經(jīng)外胚層發(fā)育而來,促進hESC向神經(jīng)外胚層分化,可以提高RPE定向誘導效率。文獻報道,轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-p)超家族受體抑制劑Compound C能提高hESC向神經(jīng)方向誘導分化效率,抑偉hESC向內(nèi)胚層、中胚層及滋養(yǎng)外胚層分化。本研究通過在誘導分化培養(yǎng)體系中加入Compound C,觀察其對RPE誘導效率的影響,并對hESC來源的RPE (hESC-RPE)細胞特性進行體外驗證,為將來hESC來源的RPE移植治療視網(wǎng)膜變性疾病提供基礎(chǔ)。 方法 將H1hESC分為對照組和Compound C處理組。對照組在細胞過度融合后,以去除堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的血清替代物(KOSR)培養(yǎng)體系誘導RPE定向分化；Compound C處理組于誘導分化前6d在培養(yǎng)體系中加入1uMCompound C。在誘導分化第1、3、5周,采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測兩組人類配對盒基因(PAX6)、小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)、細胞視黃醛結(jié)合蛋白(CRALBP)、RPE65mRNA的表達。將hESC-RPE細胞分離純化,采用RT-PCR、蛋白免疫印跡法(Western blot)、細胞免疫熒光法和吞噬實驗對純化的hESC-RPE細胞進行體外鑒定。 結(jié)果 1、在誘導分化第4周,Compound C處理組肉眼可見黑色素團塊出現(xiàn),而對照組無色素團塊出現(xiàn)。誘導分化第5周,Compound C處理組可見多個色素細胞團,對照組剛開始出現(xiàn)色素團塊。 2、RT-PCR檢測結(jié)果顯示,Compound C處理組PAX6mRNA表達在誘導分化第1、3周顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=28.498、3.141,P0.05)。誘導分化第3、5周,Compound C處理組MITF(t=8.866、10.111). CRALBP(t=5.293、5.394)和RPE65(t=9.263、9.504)的表達均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3、將Compound C處理組的色素細胞分離純化后,顯微鏡下可見所培養(yǎng)的細胞均為多角形細胞形態(tài),細胞質(zhì)充滿色素顆粒。 4、RT-PCR檢測結(jié)果顯示,hESC-RPE細胞分別與hESC、ARPE19細胞相比,PAX6、MITF、CRALBP、RPE65表達均顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(PAX6: t=9.154,7.605, P0.05; MITF:t=l7.284,16.770, P0.05; CRALBP:t=18.204,18.190, P0.05; RPE65:t=44.194, t=44.190, P0.05)。 5、Western blot檢測結(jié)果顯示,hESC-RPE細胞高水平表達RPE標志蛋白PAX6、 MITF、CRALBP、RPE65。 6、細胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示hESC-RPE細胞能表達RPE細胞特異性標志蛋白PAX6、MITF、CRALBP、RPE65、ZO-1。 7、吞噬實驗顯示,hESC-RPE細胞能吞噬聚苯乙烯熒光微球,具有吞噬功能。 結(jié)論 TGF-β受體抑制劑Compound C能顯著提高hESC向RPE細胞定向誘導效率。hESC-RPE細胞具備RPE典型的多角形、色素化外觀,能高表達RPE標志基因和蛋白,具有吞噬功能。hESC-RPE細胞表達RPE標志基因和標志蛋白顯著好于ARPE19細胞系,更加適合細胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病,為視網(wǎng)膜變性疾病的研究提供了更好的細胞平臺。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)化生長因子-β Compound C 人胚胎干細胞 視網(wǎng)膜色素上皮定向誘導
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• ~.略語/符號說明10-11
• 前言11-13
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 1.1 實驗材料與器械13-17
• 1.1.1 實驗所用的細胞13
• 1.1.2 實驗所用的試劑13-14
• 1.1.3 實驗所用的抗體14-15
• 1.1.4 實驗所用的主要儀器和設(shè)備15-16
• 1.1.5 細胞培養(yǎng)體系及主要試劑配制16-17
• 1.2 方法17-25
• 1.2.1 人胚胎干細胞培養(yǎng)、傳代及凍存17-18
• 1.2.2 分組比較hESC向RPE細胞誘導效率18
• 1.2.3 hESC-RPE細胞分離提純及傳代18-19
• 1.2.4 ARPE-19細胞系傳代、凍存及復(fù)蘇19-20
• 1.2.5 細胞總RNA提取20-21
• 1.2.6 細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄21
• 1.2.7 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)21-23
• 1.2.8 蛋白免疫印跡法鑒定hESC-RPE細胞23-24
• 1.2.9 細胞免疫熒光法鑒定hESC-RPE細胞24
• 1.2.10 hESC-RPE細胞吞噬功能檢測24
• 1.2.11 統(tǒng)計學處理24-25
• 1.3 結(jié)果25-33
• 1.3.1 H1 hESC形態(tài)學特征25
• 1.3.2 形態(tài)學觀察比較對照組和CompoundC處理組誘導效率25-26
• 1.3.3 PAX6、MITF、CRALBP、RPE65 mRNA在對照組和CompoundC處理組中的表達26-27
• 1.3.4 hESC-RPE細胞分離純化27-28
• 1.3.5 ARPE-19細胞系形態(tài)學特征28
• 1.3.6 PAX6、MITF、CRALBP、RPE65 mRNA在hESC、ARPE-19、hESC-RPE細胞中的表達28-29
• 1.3.7 PAX6、MITF、CRALBP、RPE65蛋白在hESC、ARPE-19、hESC-RPE細胞中的表達29-30
• 1.3.8 hESC-RPE細胞免疫熒光結(jié)果30-32
• 1.3.9 hESC-RPE細胞吞噬功能檢測結(jié)果32-33
• 1.4 討論33-39
• 1.4.1 hESC向RPE細胞定向誘導分化33-34
• 1.4.2 RPE細胞標志基因和蛋白：Pax6、MITF、CRALBP、RPE6534-35
• 1.4.3 Compound C促進hESC向RPE細胞定向誘導分化35-37
• 1.4.4 hESC-RPE細胞分離提純37
• 1.4.5 hESC-RPE細胞功能鑒定37-39
• 1.5 小結(jié)39-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-46
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明46-47
• 綜述47-60
• 綜述參考文獻55-60
• 致謝60

【共引文獻】

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