本文關鍵詞：沉默信號調控因子1蛋白促進高糖環(huán)境下角膜上皮細胞損傷修復的實驗研究

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【摘要】：第一部分沉默信號調控因子1(Sirtl)在1型糖尿病模型小鼠角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中的表達 目的：探討沉默信號調控因子(Sirt1)在1型糖尿病模型C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中的表達,為明確Sirt1與糖尿病性角膜病變的關系奠定基礎。 方法：取雄性C51BL/6-Ins2Akita+/J小鼠與同窩出生的野生型雄性C57BL/6-Ins2-/+小鼠各8只,分別作為1型糖尿病模型組和正常對照組。分別于24周齡、28周齡、32周齡、36周齡、40周齡、44周齡、48周齡測量兩組小鼠的體重、血糖、淚液分泌情況,同時行虎紅染色觀察淚膜及上皮情況；于48周齡時頸椎脫臼法處死,取小鼠的三叉神經(jīng)節(jié)和角膜組織。采用蘇木素-伊紅染色顯示兩組小鼠的角膜和三叉神經(jīng)節(jié)的組織病理學變化；行免疫組織化學法檢測角膜和三義神經(jīng)節(jié)中Sirt1蛋白的表達和定位；行熒光定量PCR法檢測Sirt1mRNA在角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中的表達；行Western blot檢測兩組小鼠角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中Sirt1蛋白的相對表達量,并進行統(tǒng)計學分析。 結果：與C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠相比,C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的體重明顯較輕(t=22.784,P=0.000),淚液分泌減少(t=10.693,P=0.000),虎紅染色著色明顯。C57BL/6-Ins2Akita+J小鼠的三叉神經(jīng)節(jié)細胞大小不均勻,排列較疏松,神經(jīng)纖維排列較散亂,角膜上皮變薄、細胞層數(shù)減少；而C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠的神經(jīng)節(jié)細胞大小、形態(tài)較為均一,排列緊密、整齊,神經(jīng)纖維排列較整齊。熒光定量PCR顯示,Sirt1mRNA在C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜的表達強度顯著低于野生型C57BL/6-Ins2+/+小鼠(0.53±0.08vs.0.97±0.12),差異有統(tǒng)計學意義(t=-5.863,P=0.003)；在C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠三義神經(jīng)節(jié)的表達灰度為2.43±0.19,低于野生型C57BL/6-Ins2+/+小鼠(2.50±0.23),但差異無統(tǒng)計學意義(t=0.582,P=0.611).Western blot顯示,C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜中Sirt1蛋白的表達明顯低于野生型C57BL/6-Ins2+/+小鼠(0.778±0.017vs.1.306±0.014),差異有統(tǒng)計學意義(t=33.141,P=0.001)；但Sirt1蛋白在兩組小鼠的三叉神經(jīng)節(jié)中的表達差異無統(tǒng)計學意義(1.100±0.016vs.1.108±0.018,t=0.431,P=0.708). 結論：Sirt1在48周齡1型糖尿病C51BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的角膜中的表達降低,提示Sirt1有可能參與糖尿病性角膜病變。 第二部分過量表達Sirt1蛋白對高糖環(huán)境下角膜上皮損傷修復的影響 目的：研究Sirt1對高糖環(huán)境下角膜上皮損傷修復的影響及其作用機制。 方法：取雄性C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠20只與同窩出生的野生型雄性C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠5只分成五組：C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠角膜損傷不處理組、C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜損傷不處理組、C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜損傷結膜下注射生理鹽水組(1OuL)、C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜損傷結膜下注射Ad-GFP組(10uL滴度為1011的重組GFP腺病毒)和C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜損傷結膜下注射Ad-Sirt1組(10uL滴度為1011的重組Sirt1腺病毒)。角膜上皮刮除后,立即結膜下注射相應物質。損傷48h后,通過Western blot分別比較前兩組之問、后四組之間小鼠角膜組織中乙�；痯53、胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3蛋白)、胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)、乙酰化的蛋白激酶B (p-AKT)等蛋白的表達量,進而顯示過量表達Sirt1對C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜組織中p53、IGFBP3/IGF-1/AKT的表達的影響。通過熒光素鈉染色并分別于傷后0h、24h、48h裂隙等下觀察并照相顯示過量表達Sirt1對糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復的影響。 結果：糖尿病小鼠角膜上皮刮除后,熒光素鈉染色結果表明結膜下注射重組SIRT1腺病毒的糖尿病小鼠48小時后角膜上皮損傷愈合的面積顯著低于未進行SIRT1腺病毒注射組,說明過量表達Sirt1后促進了糖尿病小鼠角膜的損傷修復。與野生型小鼠相比,糖尿病小鼠的角膜組織中乙酰化p53、IGFBP3蛋白表達明顯上調,而Sirt1、IGF-1R、p-AKT顯著下調。結膜下注射重組SIRT1腺病毒的C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的角膜組織中乙�；痯53、IGFBP3蛋白表達較未注射時顯著下調,而IGF-1R、乙�；疉TK蛋白表達顯著增加,其表達量均與野生型小鼠相當。 結論：Sirt1通過抑制p53乙酰化調控IGFBP3/IGF-1/AKT通路,進而促進角膜上皮修復。Sirt1對糖尿病角膜病變有保護作用。
【關鍵詞】：沉默信號調控因子1 1型糖尿病 糖尿病角膜病變 上皮修復
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R587.2;R772.2
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 第一部分 沉默信號調控因子1(Sirt1)在1型糖尿病模型小鼠角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中的表達9-33
• 引言9-11
• 第一章 實驗材料和試劑11-13
• 1.1 實驗動物11
• 1.2 儀器11
• 1.3 試劑11-13
• 第二章 實驗方法和實驗步驟13-20
• 2.1 動物模型及分組13
• 2.2 小鼠體重、血糖的觀察13
• 2.3 小鼠淚液分泌的觀察13
• 2.4 1%虎紅染色角膜上皮損害檢測13
• 2.5 蘇木素-伊紅染色檢測三叉神經(jīng)節(jié)與角膜的組織病理學該變13-14
• 2.6 免疫組織化學染色檢測Sirt1的表達14-15
• 2.7 SYBR real time PCR法檢測Sirt1 mRNA的表達15-17
• 2.8 Western blot檢測角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中Sirt1蛋白的表達17-19
• 2.9 統(tǒng)計學處理19-20
• 第三章 實驗結果20-28
• 3.1 小鼠體重的變化20-21
• 3.2 小鼠血糖變化情況21
• 3.3 小鼠淚液分泌的觀察21-22
• 3.4 1%虎紅染色情況22-23
• 3.5 蘇木精-伊紅染色檢測三叉神經(jīng)節(jié)與角膜組織的改變23-25
• 3.6 Sirtl蛋白在兩組小鼠角膜中的表達25
• 3.7 熒光定量PCR法檢測Sirt1 mRNA的表達25-26
• 3.8 Westorn blot檢測Sirt1蛋白的表達26-28
• 第四章 討論28-30
• 4.1 小鼠模型的選擇28
• 4.2 1%虎紅角膜染色在糖尿病角膜病變中的意義28
• 4.3 檢測Sirt1蛋白的意義28-30
• 第五章 結論30-31
• 參考文獻31-33
• 第二部分 過量表達Sirt1蛋白對高糖環(huán)境下角膜上皮損傷修復的影響33-45
• 引言33-35
• 第一章 實驗材料和試劑35-36
• 1.1 實驗動物35
• 1.2 儀器35
• 1.3 試劑35-36
• 第二章 實驗方法和實驗步驟36-37
• 2.1 動物模型及分組36
• 2.2 模型的建立36
• 2.3 熒光素鈉染色36
• 2.4 Sirt1、p53以及IGFBP3/IGF-1/AKT通路的檢測36
• 2.5 統(tǒng)計學處理36-37
• 第三章 實驗結果37-40
• 3.1 熒光素鈉染色角膜上皮損傷檢測37-38
• 3.2 Western blot檢測小鼠角膜各因子表達38-40
• 第四章 討論40-42
• 第五章 結論42-43
• 參考文獻43-45
• 綜述45-54
• 參考文獻49-54
• 攻讀學位期間的研究成果54-55
• 致謝55-56

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本文編號：885805