發(fā)布時間：2017-09-20 04:02

  本文關(guān)鍵詞：UBA52與Hsf4b的相互作用及調(diào)控

  更多相關(guān)文章： UBA52 Hsf4b 相互作用 泛素化 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

【摘要】：背景 研究發(fā)現(xiàn)，，Hsf4基因突變時，會引發(fā)新生兒先天性白內(nèi)障，在動物實驗中，敲除小鼠Hsf4基因，導致新生小鼠晶狀體發(fā)育障礙，因此hsf4基因在新生兒晶狀體發(fā)育過程中至關(guān)重要。 熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族有四個成員，Hsf4是其中之一，它有Hsf4a和Hsf4b兩個亞型，而在眼晶狀體中，只表達Hfs4b這一亞型。研究發(fā)現(xiàn)，Hsf4b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對晶狀體早期發(fā)育至關(guān)重要，Hsf4b主要在新生晶狀體的上皮細胞和次級纖維細胞內(nèi)表達，它能激活小分子熱休克蛋白Hsp25、γ和β晶狀體蛋白的表達，調(diào)控晶狀體上皮細胞增生和纖維細胞分化。已報道，在晶狀體上皮細胞和纖維細胞分化過程中，泛素-蛋白酶體被激活，參與調(diào)控蛋白的降解和去除細胞內(nèi)的膜性細胞器。我們運用酵母雙雜交技術(shù)探索hsf4b相互作用的蛋白時，發(fā)現(xiàn)UBA52蛋白可與Hsf4b相互作用。 UBA52又稱為泛素核糖體融合蛋白，是一個由N-端泛素分子和C-端核糖體L40組成的融合蛋白。在細胞內(nèi)，蛋白酶可在UBA52蛋白72位的氨基酸處切割，轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨姆核胤肿雍蚅40核糖體分子。UBA52是細胞內(nèi)泛素分子的一種存在形式，通過對蛋白的泛素化將蛋白轉(zhuǎn)運到蛋白酶體降解或介導細胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運及蛋白之間的相互作用。本實驗驗證了UBA52與Hsf4b之間的相互作用和UBA52對Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的影響，至于二者之間調(diào)控的作用機理及產(chǎn)生的生物學效應，還有待進一步探究。 目的 利用體外實驗過表達UBA52和Hsf4b，研究Hsf4b與UBA52的相互作用，并利用免疫熒光進行UBA52和Hsf4b的亞細胞定位。初步探究Hsf4b對泛素化過程的影響，驗證UBA52是否對Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性具有調(diào)控作用。 方法 通過Pull-down和免疫共沉淀技術(shù)驗證UBA52與Hsf4b的相互作用，及與Hsf4b相互作用的結(jié)構(gòu)域。用免疫熒光對UBA52與Hsf4b進行亞細胞定位。原核表達UBA52蛋白，利用Western Blot檢測Hsf4b對泛素化修飾的影響及UBA52對Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的影響。 結(jié)果 （1）免疫共沉淀表明Hsf4b能夠與泛素分子結(jié)合，且UBA52與Hsf4b（196-493）功能區(qū)域相結(jié)合，免疫熒光顯示二者在細胞核內(nèi)共定位。 （2）UBA52在體內(nèi)可被剪切為泛素分子和核糖體蛋白L40，Western Blot表明在體內(nèi)Hsf4b對UBA52的剪切沒有影響。 （3）免疫共沉淀表明UBA52與Hsf4b雖然存在相互作用，但UBA52沒有直接泛素化修飾Hsf4b。 （4）通過原核表達UBA52蛋白，把它和正常mlec細胞及能穩(wěn)定過表達Hsf4b的mlec細胞裂解液在一定溫度下孵育后，發(fā)現(xiàn)UBA52蛋白在體外也能被剪切，并且和過表達Hsf4b的mlec細胞裂解液孵育那組，Western Blot顯示其泛素化明顯增加，初步說明Hsf4b能促進泛素化修飾。 （5）Western Blot表明，當UBA52存在時，Hsf4b下游蛋白αB的表達量增加。 結(jié)論 UBA52與Hsf4b之間具有相互作用，但UBA52未直接泛素化修飾Hsf4b。Hsf4b對UBA52的剪切沒有影響。Hsf4b能夠促進泛素化修飾，而UBA52能夠上調(diào)Hsf4b下游基因αB的表達。
【關(guān)鍵詞】：UBA52 Hsf4b 相互作用 泛素化 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R776.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 英文縮略詞表11-13
• 前言13-15
• 1 材料與方法15-25
• 1.1 主要材料與試劑15-16
• 1.1.1 細菌、細胞和質(zhì)粒來源15
• 1.1.2 主要試劑15
• 1.1.3 主要抗體15
• 1.1.4 主要儀器設(shè)備15-16
• 1.2 主要試劑配制16-21
• 1.2.1 培養(yǎng)細胞所需配制的試劑16-17
• 1.2.2 培養(yǎng)細菌的溶液17
• 1.2.3 SDS-PAGE 溶液的配制17-20
• 1.2.4 免疫熒光實驗試劑的配制20-21
• 1.3 主要方法21-25
• 1.3.1 提取質(zhì)粒21
• 1.3.2 制備感受態(tài)21
• 1.3.3 轉(zhuǎn)化21
• 1.3.4 細胞培養(yǎng)的方法21-22
• 1.3.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞22
• 1.3.6 細胞的裂解及蛋白濃度的測定22
• 1.3.7 Western Blot 方法22-23
• 1.3.8 原核蛋白誘導表達23-24
• 1.3.9 免疫共沉淀24
• 1.3.10 免疫熒光24
• 1.3.11 GST pull-down24-25
• 2 結(jié)果25-33
• 2.1 CO-IP 驗證 UBA52 與 HSF4B 相互作用25
• 2.2 UBA52 和 HSF4B 在細胞內(nèi)共定位25-26
• 2.3 PULL-DOWN 驗證 UBA52 與 HSF4B（196-493）功能區(qū)域結(jié)合26-27
• 2.4 HSF4B 過表達對 UBA52 在體內(nèi)剪切沒有影響27-28
• 2.5 CO-IP 表明 UBA52 與 HSF4B 是間接相互作用28-29
• 2.6 原核表達 UBA52 蛋白并驗證與 HSF4B 在體外的相互作用29-30
• 2.7 UBA52 對 HSF4B 轉(zhuǎn)錄活性的影響30-33
• 3 討論33-37
• 4 結(jié)論37-39
• 5 參考文獻39-41
• 綜述41-51
• 參考文獻48-51
• 致謝51-53
• 在讀期間發(fā)表的學術(shù)論文53-54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 徐存拴,熊蕾,盧龍斗;熱休克蛋白(HSPs)在胚胎發(fā)育中作用的研究進展(英文)[J];Developmental & Reproductive Biology;2000年01期

2 劉世榮;何維;;SUMO化修飾:一種多功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[J];醫(yī)學分子生物學雜志;2006年03期

3 龔小衛(wèi);姜勇;;絲裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶(MK)研究進展[J];生物化學與生物物理進展;2007年07期

4 龔小衛(wèi),姜勇;絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)生物學功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[J];中國生物化學與分子生物學報;2003年01期

本文編號：885767