本文關(guān)鍵詞：鼻咽癌抑瘤基因DLC1作用機制初步研究

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【摘要】：鼻咽癌是我國南方省份和東南亞地區(qū)一種高發(fā)的惡性腫瘤,有著特殊的種族和地理分布。病因?qū)W研究認(rèn)為,鼻咽癌是由遺傳因素、環(huán)境因素、EBV (Epstein-Barr virus)感染共同作用引發(fā)的。由于鼻咽癌發(fā)生時沒有明顯的病痛,鼻咽癌患者被確診時往往已經(jīng)是晚期階段。目前為止,鼻咽癌的發(fā)病機理研究雖然取得了很大的進(jìn)展,但是其真正的發(fā)病機制仍尚未完全闡明,這就使得鼻咽癌的早期診斷及臨床治療非常困難。因此,找到與鼻咽癌早期診斷相關(guān)的信號分子并應(yīng)用于臨床有著重要的意義。 肝癌缺失基因-1(Deleted in liver cancer1, DLC1)是Yuan等在1998年首次從肝臟組織中通過代表性差異分析(representational difference analysis, RDA)方法克隆獲得。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)DLC1在鼻咽癌中出現(xiàn)較高比例的表達(dá)下調(diào)或缺失,而這種改變與DLC1啟動子區(qū)域DNA異常甲基化和微衛(wèi)星位點的雜合性丟失(LOH)有關(guān)。為進(jìn)一步研究DLC1在鼻咽癌中的作用機制,本課題組選擇了DLC1基因表達(dá)缺失的高成瘤、高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系5-8F,利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)DLC1,建立穩(wěn)定表達(dá)DLC1基因的細(xì)胞系5-8F-DLC1及對照組細(xì)胞系5-8F-vector。研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)DLC1的5-8F細(xì)胞,細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,細(xì)胞骨架的形成和分布發(fā)生改變,細(xì)胞的增殖能力、遷移和侵襲能力均呈現(xiàn)不同程度的下降。 本研究擬在前期工作基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步研究DLC1在鼻咽癌中的作用機制。 目的： 應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù),篩選出過表達(dá)DLC1的鼻咽癌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因,分析其中差異表達(dá)的基因的內(nèi)在聯(lián)系,研究DLC1在鼻咽癌中的作用機制。 方法： 1利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對5-8F-vector和5-8F-DLC1兩株細(xì)胞進(jìn)行分析,然后用生物分子功能注釋系統(tǒng)MAS3.0中的KEGG以及GO軟件對芯片結(jié)果中差異表達(dá)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測DLC1在鼻咽癌中可能參與調(diào)控的信號通路及關(guān)鍵分子。 2利用RT-PCR和Real-time PCR技術(shù)對芯片結(jié)果中部分上調(diào)和下調(diào)的基因進(jìn)行驗證。 3應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對5-8F-vector和5-8F-DLC1兩株細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。 4利用線粒體膜電位檢測試劑盒對5-8F-vector和5-8F-DLC1兩株細(xì)胞進(jìn)行線粒體膜電位檢測。 5運用western blot技術(shù)對線粒體凋亡相關(guān)分子進(jìn)行檢測,初步探討DLC1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用機制。 6運用western blot技術(shù)對轉(zhuǎn)移相關(guān)分子進(jìn)行檢測,初步探討其抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用機制。 結(jié)果： 1基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),與5-8F-vector細(xì)胞相比,5-8F-DLC1中454個基因表達(dá)上調(diào),如IGFBP7、TNS1、TP53、TP63等386個基因表達(dá)下調(diào),如EGFR、KRAS、TGFβ32等。GO分析發(fā)現(xiàn),DLC1引起21種生物學(xué)功能發(fā)生了改變；KEGG分析發(fā)現(xiàn),DLC1可能參與調(diào)控30條不同的信號通路。 2RT-PCR和Real-time PCR技術(shù)對芯片結(jié)果中部分上調(diào)基因(WNT5A、TNS1、FHL1、S100A2、RECK、DUSP、CASP9、IGFBP7)以及下調(diào)的基因(EGFR、CDCP1、KRAS、TGFβ2、Akt3、MMP7、 MUC4、BCL10、PTK6)進(jìn)行驗證,結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)一致。 3流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,5-8F-DLC1細(xì)胞凋亡率明顯高于5-8F-vector細(xì)胞。 4線粒體膜電位檢測發(fā)現(xiàn),5-8F-DLC1細(xì)胞膜電位低于5-8F-vector細(xì)胞。 5Western blot結(jié)果顯示,與5-8F-vector細(xì)胞相比較,5-8F-DLC1細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的分子(如caspase9、caspase3、細(xì)胞色素c、Bcl-2、 Bax等)以及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子(如MMP2、MMP7、MMP9、Snail、 E-cadherin、TRAF5、NF-κB等)均發(fā)生了明顯的改變。 結(jié)論 1在鼻咽癌中過表達(dá)抑瘤基因DLC1,會影響鼻咽癌細(xì)胞中的部分瘤基因、抑瘤基因以及其它一些重要的信號分子的表達(dá)。生物信息學(xué)分析表明,DLC1參與調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞中一些重要的信號通路。 2DLC1能通過線粒體凋亡通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 3DLC1可能通過PI3K/Akt/NF-KB/Snail或TRAF5/NF-KB/Snail信號通路抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 DLC-1基因 基因芯片 細(xì)胞凋亡 侵襲與轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-15
• 縮略語簡表15-16
• 前言16-20
• 技術(shù)路線20-22
• 第一章 鼻咽癌5-8F細(xì)胞中過表達(dá)DLC1后的基因表達(dá)譜分析及驗證22-35
• 第一節(jié) 材料與方法22-27
• 1. 材料22-24
• 2. 方法24-27
• 第二節(jié) 實驗結(jié)果27-33
• 1. RNA質(zhì)量檢測27
• 2. 過表達(dá)DLC1的5-8F細(xì)胞中DLC1基因檢測27-28
• 3. 芯片掃描結(jié)果28
• 4. 基因表達(dá)譜芯片結(jié)果分析28
• 5. 利用GO和KEGG軟件在線分析芯片結(jié)果28-32
• 6. RT-PCR和Real-time PCR驗證芯片結(jié)果32-33
• 第三節(jié) 分析與討論33-35
• 第二章 DLC1通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡35-46
• 第一節(jié) 材料與方法35-40
• 1. 材料35-36
• 2 方法36-40
• 第二節(jié) 實驗結(jié)果40-43
• 1 Western blot檢測5-8F-vector和5-8F-DLC1細(xì)胞中DLC-1蛋白的表達(dá)40
• 2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,過表達(dá)DLC1后鼻咽癌細(xì)胞凋亡率上升40-41
• 3 線粒體膜電位檢測41
• 4 過表達(dá)DLC1能促進(jìn)線粒體凋亡關(guān)鍵分子caspase-9和Cytochrome c表達(dá)41-42
• 5 過表達(dá)DLC1能促進(jìn)Apaf-1和caspase-3的表達(dá)42
• 6 過表達(dá)DLC1,促凋亡分子Bax表達(dá)水平上升,抑制凋亡分子Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)受到抑制42-43
• 第三節(jié) 分析與討論43-46
• 第三章 DLC1通過PI3K/Akt和NF-κB/Snail或是TRAF5/NF-κB/Snail信號通路抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移46-52
• 第一節(jié) 材料和方法46-47
• 1、材料46
• 2、方法46-47
• 第二節(jié) 實驗結(jié)果47-49
• 1 過表達(dá)DLC1后TNFR相關(guān)因子TRAFs家族成員TRAF5在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中的表達(dá)下降47
• 2 過表達(dá)DLC1后,磷酸化Akt1/2表達(dá)受到抑制,PI3K表達(dá)下調(diào)47
• 3 過表達(dá)DLC1后,NF-κB家族成員p65以及磷酸化p65、p105表達(dá)受到抑制47
• 4 過表達(dá)DLC1后明顯抑制MMP2/7/9在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中的表達(dá)47-48
• 5 過表達(dá)DLC1后,細(xì)胞黏附分子E-cadherin表達(dá)明顯上升,而轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)受到抑制48-49
• 第三節(jié) 分析與討論49-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-61
• 綜述 DLC-1與腫瘤61-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 致謝68-69
• 攻讀學(xué)位期間主要研究成果目錄69

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 ;Genetic and Epigenetic Alterations of DLC-1,a Candidate Tumor Suppressor Gene,in Nasopharyngeal Carcinoma[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2006年05期

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本文編號：863116