發(fā)布時間：2017-09-16 11:41

  本文關(guān)鍵詞：瞬時受體電位M7通道在喉癌及癌旁組織表達差異的初步研究

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【摘要】：背景 喉癌的發(fā)病率占耳鼻喉惡性腫瘤的11-22%,全身惡性腫瘤的1-5%。喉鱗狀細(xì)胞癌對放化療均不敏感,在我國,治療手段仍以手術(shù)為主。盡管治療手段在不斷提高,但患者的無病生存率及生活質(zhì)量改善欠佳。手術(shù)治療喉癌常需行氣管切開術(shù)或氣管造瘺術(shù),術(shù)后患者聲音嘶啞或不能發(fā)音,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。早期喉癌的治療損傷性較小,尚可保留喉功能,獲得較為理想的生活質(zhì)量,因而喉癌的早期診斷對患者的預(yù)后意義重大。表皮生長因子受體(EGFR)、P53、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)等生物學(xué)標(biāo)記物的表達與腫瘤的生長、治療及預(yù)后有關(guān)。從分子生物學(xué)角度探討喉癌的發(fā)生、發(fā)展機制已逐漸被關(guān)注,旨為喉癌的臨床診斷、治療方案的制定及預(yù)后的評估提供實驗室依據(jù)。 瞬時受體電位(transient receptor potential, TRP)通道最初在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn),是維持細(xì)胞膜離子平衡的主要通道,激活鈣離子通道調(diào)節(jié)鈣離子平衡或改變細(xì)胞膜電位,亦可通過特定的離子調(diào)控通道控制鈣離子內(nèi)流。TRPM通道是TRP通道的亞家族之一,其命名源于第一個家族成員melastatin (TRPM1)的發(fā)現(xiàn),目前擁有八個成員：TRPM1-TRPM8。TRPM7通道廣泛表達于機體各類器官及組織細(xì)胞中,參與維持細(xì)胞增殖、分化、粘附、轉(zhuǎn)移及神經(jīng)遞質(zhì)釋放等多項生理活動。研究表明TRPM7還參與心血管、消化及泌尿系等多類系統(tǒng)疾病的病理生理活動。Nelson等下調(diào)胰腺腺癌TRPM7的表達可誘導(dǎo)細(xì)胞的非程序性衰老及死亡,同時還發(fā)現(xiàn)與吉西他濱聯(lián)用可增強細(xì)胞毒性。Guilbert等證實TRPM7通道在雌激素受體陰性表達的乳腺導(dǎo)管腺癌中較正常乳腺組織高表達,且認(rèn)為TRPM7通道是通過激酶結(jié)合域而非鈣離子內(nèi)流的方式參與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,這將為雌激素受體陰性表達的乳腺導(dǎo)管腺癌的治療提供新的生物標(biāo)記物及潛在的治療靶點。 近年來,TRPM7通道與頭頸腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系正逐漸被人們重視。Chen等認(rèn)為TRPM7通道以調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流的方式參與人類鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,表達下降可降低癌細(xì)胞株的生長及侵襲能力。Hanano等證實視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)細(xì)胞株可表達TRPM7通道蛋白,該通道可以自發(fā)產(chǎn)生陽離子電流(Ispont)及非電壓門控性鈣離子內(nèi)流；當(dāng)TRPM7表達下降時,Ispont及鈣離子內(nèi)流降低,細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變減慢,減緩細(xì)胞增殖速度。Jiang等研究證實TRPM7可表達于FaDu細(xì)胞株和SCC25細(xì)胞株(兩種人類頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株),Ca2+電流與TRPM7表達水平呈正比,運用非特異性TRPM7受體阻滯劑(2-APB、Gd3+)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長,說明TRPM7通道蛋白的表達水平與腫瘤的生長呈正相關(guān)。 目的及意義 目前TRPM7通道在人類喉惡性腫瘤的作用鮮有報道,運用分子生物學(xué)技術(shù)檢測喉癌組織及癌旁正常黏膜組織TRPM7通道的表達水平,并對其表達的差異性進行研究分析；探討TRPM7通道在喉癌的病理分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等組間的表達有無差異性,期望為喉鱗狀細(xì)胞癌的臨床診斷、靶向治療及預(yù)后評估提供新穎的理論及實驗室依據(jù)。 方法 1、標(biāo)本的收集 (1)石蠟標(biāo)本篩選2013年1月至2013年10月于廣東省人民醫(yī)院診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌患者的石蠟組織標(biāo)本,符合要求者共計18例。組織10%中性甲醛固定后,由我院病理科石蠟包埋,行蘇木素-伊紅染色病理確診。 (2)冰凍標(biāo)本收集2013年11月至2014年2月于我院診斷為原發(fā)性喉鱗狀細(xì)胞癌的患者13例,標(biāo)本離體后收集癌組織及癌周正常組織,保存于無Rnase離心管中,液氮運輸,-80-C超低溫冰箱凍存。癌旁正常組織標(biāo)本經(jīng)HE染色證實未見癌細(xì)胞浸潤。 (3)入組患者均符合以下要求：①患者均為原發(fā)性喉癌,且全身無轉(zhuǎn)移及未曾罹患其他惡性腫瘤,術(shù)后病理玻片經(jīng)HE染色示鱗狀細(xì)胞癌,癌旁正常黏膜組織可見排列整齊的復(fù)層鱗狀細(xì)胞；②所有患者術(shù)前均未接受放射治療或化學(xué)治療；③患者入院均行開放性手術(shù)治療；④癌組織標(biāo)本行蘇木素-伊紅染色(HE染色)提示鱗狀細(xì)胞癌,癌旁組織均可見正常鱗狀上皮細(xì)胞。 排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有癌癥史的患者或曾接受放療、化療或行同位素治療的患者均不納入研究范圍。 2、免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片經(jīng)S-P免疫組化法染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。采用Bresalier半定量公式判斷染色結(jié)果,對染色結(jié)果進行半定量分析：將免疫染色玻片在10倍物鏡視野下觀察,隨機選取5個視野,并記錄其染色強度,根據(jù)染色強度分為四級,并分別計分：細(xì)胞無著色,陰性(0分)；細(xì)胞染色為淺黃色,弱陽性(1分)；細(xì)胞著色為棕黃色,陽性(2分)；細(xì)胞著色為棕褐色,強陽性(3分),計算每一強度的視野數(shù),根據(jù)公式：染色強度=∑｛(0xF0)+(1×F1)+(2×F2)+(3xFi)),Fi=%10×視野數(shù)(i=0,1,2,3)計算每張玻片的染色強度。本實驗中分別計算出患者癌組織及癌旁正常組織的染色強度,對TRPM7蛋白在喉癌及癌旁組織的表達進行定位及半定量分析。 3、實時熒光定量PCR 運用試劑盒提取冰凍組織的總RNA,行逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA,以GAPDH為內(nèi)參,設(shè)計目的基因及內(nèi)參基因的引物序列,運用SYBR GREEN I熒光定量PCR試劑盒及羅氏Lightcycler480Ⅱ熒光定量PCR檢測儀,獲得Ct值。本實驗采用相對定量法,Microsoft Excle軟件計算2-△△Ct分析喉鱗癌組織及癌旁正常組織TRPM7基因的相對差異。本實驗適用的公式：△△Ct=(Ct目的-Ct內(nèi)參)腫瘤-(Ct目的-Ct內(nèi)參)正常。 4、統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢測及方差齊性檢測,符合正態(tài)分布的資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s),采用t檢驗對患者TRPM7通道的表達進行分析；不服從正態(tài)分布的資料用M(P25-P75)表示,采用配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗對患者TRPM7通道的表達情況進行分析。 P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1、患者全部為男性,年齡為48-75歲,石蠟包埋組織中低分化2例,中分化9例,高分化7例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5例(中分化3例,低分化2例)。冰凍組織中高分化者2例,低分化者1個,中分化者10例。 2、免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果示正常喉粘膜組織及喉癌組織胞漿均可表達TRPM7通道蛋白,運用Bresalier半定量公式判斷染色結(jié)果如下：經(jīng)檢驗樣本服從正態(tài)分布,腫瘤組織表達強度為7.830±2.572,癌旁組織表達強度為4.560±2.148;采用配對t檢驗示TRPM7通道在喉鱗癌組織及癌旁正常組織的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.979,p=0.001)；喉癌低分化、中分化和高分化三組間TRPM7表達強度分別為10.000±2.828、8.444±2.128和6.571±2.820；經(jīng)檢驗符合方差齊性,采用多個獨立樣本的t檢驗示表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.945,P=0.177)；兩獨立樣本t檢驗分析TRPM7在癌組織的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TRPM7的表達強度為9.400±1.140,未轉(zhuǎn)移者TRPM7的表達強度為7.308±2.810,結(jié)果示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移的患者中TRPM7蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.591,p=0.131)。 3、熒光定量PCR對TRPM7-RNA在喉癌組織及癌旁正常組織的表達進行定量分析。對ACt進行正態(tài)分布性檢測得結(jié)果不服從正態(tài)分布,喉癌組織的ACt值為7.140(6.515～10.190),癌旁正常組織的ACt為7.430(6.470-8.240)。運用2-△△Ct計算法得出有2例患者(15.39%)的TRPM7表達水平在腫瘤組織較癌旁正常組織上調(diào)2倍以上；運用配對樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗示兩組組織的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(z=-0.664,p=0.507)。 結(jié)論 本研究首次證實了TRPM7通道可在人類喉癌組織及癌旁正常黏膜組織的表達,試探討TRPM7通道在鱗癌的表達水平及意義。 免疫組織化學(xué)檢測證實TRPM7通道在喉鱗癌組織及癌旁正常鱗狀上皮組織均可表達,表達位點為胞漿,且表達強度差異有統(tǒng)計學(xué)差異；但TRPM7通道蛋白在喉癌的病理分型及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移的組間表達無明顯相關(guān)性。新鮮冰凍組織行實時熒光定量PCR結(jié)果示喉癌組織及癌旁組織的表達水平無明顯差異性,與免疫組化的結(jié)果不一致,這可能是由于RNA翻譯合成蛋白質(zhì)的過程中受到離子通道或其他分子機制影響或無法完全避免RNA污染、降解,及樣本量較少等原因所致,因此尚不能絕對肯定TRPM7通道在兩組組織的表達無差異。
【關(guān)鍵詞】：喉鱗狀細(xì)胞癌 TRPM7 免疫組織化學(xué) 熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.65
【目錄】：

• 摘要3-16
• 摘要3-8
• ABSTRACT8-13
• 參考文獻13-16
• 前言16-20
• 材料與方法20-31
• 一、材料20
• 二、主要試劑及儀器20-24
• 三、實驗方法24-30
• 四、統(tǒng)計學(xué)分析30-31
• 結(jié)果31-35
• 一、HE染色31
• 二、免疫組織化學(xué)染色31-32
• 三、TRPM7-RNA在喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常喉粘膜組織的表達32-35
• 討論35-47
• 一、喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機制的研究進展35-36
• 二 TRPM研究現(xiàn)況36-39
• 三、TRPM7通道蛋白在喉癌及癌旁正常組織的表達39-40
• 四、TRPM7通道基因在人類喉癌組織及癌旁正常鱗狀上皮組織的表達40-42
• 五、TRPM7通道在癌組織的表達與臨床診斷42-45
• 六、內(nèi)源性因子及外源性藥物影響胞外TRPM7通道的表達及活性45-47
• 結(jié)論47-48
• 全文總結(jié)與創(chuàng)新48-49
• 待完善的實驗49-50
• 參考文獻50-57
• 期間成果57-58
• 綜述58-68
• 參考文獻65-68
• 致謝68-70
• 論文統(tǒng)計學(xué)評議70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 張?zhí)祜w,郭光金,王林,蔣登金,左艷芳,張集建;RT-PCR與免疫組化在自體移植脾組織GAP-43表達檢測中的應(yīng)用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年05期

2 郭曉強;馬克世;;冷受體TRPM8在冷感知中的作用和調(diào)節(jié)[J];生命的化學(xué);2008年04期

3 侯菊花;黃健;王國華;侯巧燕;;KLF6、p21及c-Jun在頭頸部腫瘤組織芯片中的表達[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2010年18期

4 杜晶;張勵才;;TRPM8的研究進展[J];中國藥理學(xué)通報;2008年09期

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本文編號：862838