本文關(guān)鍵詞：siRNA沉默葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78增強(qiáng)人鼻咽癌細(xì)胞對(duì)順鉑及放療的敏感性

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【摘要】：目的： 1.探討順鉑（cisplatin，DDP）及電離輻射（ionizingradiation，IR）對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的影響。 2.探討小干擾RNA(Small-interferenceRNA，siRNA)下調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulatedprotein78，GRP78)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制及凋亡的影響。 方法： 1.MTT法探討DDP(2，4，8，16，32μM)、IR(2，4，6，8，10Gy)處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP24、48h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響，以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系； 2.PI單染，PI/AnnexinV雙染及線粒體膜電位JC-1流式檢測(cè)DDP（6μM）、IR（4Gy）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的影響； 3.Westernblot法探討DDP（6μM）處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP6、16、24h后對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)的影響以及探討IR(2，4，6，8，10Gy)處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP24h后對(duì)GRP78表達(dá)的影響； 4.siRNA法下調(diào)GRP78后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，Westernblot法檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞中GRP78及其他凋亡蛋白的表達(dá)，PI/AnnexinV雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡的影響； 結(jié)果： 一、鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP對(duì)DDP具有耐藥性 1.MTT法顯示：4μMDDP作用于人鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP、HNE124、48h后細(xì)胞存活率分別為92.8%、60.13%、和85.68%、49.34%。HNE1/DDP的IC50=24.96，HNE1的的IC=6.3，RI=6.96。 2.6μMDP刺激人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24h后，PI/AnnexinV流式檢測(cè)，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為23.4%和10.1%，與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PI流式檢測(cè)，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為11.4%和6.6%，與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；線粒體膜電位JC-1檢測(cè)，人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的平均熒光強(qiáng)度（紅光的平均熒光強(qiáng)度/綠光的平均熒光強(qiáng)度）為3.05、1.89，與陰性對(duì)照5.15、2.02相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.經(jīng)6μMDDP處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP6、16、24h后，Westernblot法檢測(cè)了凋亡蛋白Caspase-3在HNE1中自16h起出現(xiàn)剪切，而在HNE1/DDP沒(méi)有出現(xiàn)剪切。 二、鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP對(duì)IR具有放射耐受性 1.MTT法顯示：4GyIR作用于人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24、48h后細(xì)胞存活率分別為77.3%、89.5%和85.8%、93.0%。 2.4GyIR處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24h后，PI/AnnexinV流式檢測(cè)，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為30.4%和12.4%，與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PI流式檢測(cè)，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為28.1%和15.9%，與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；線粒體膜電位JC-1檢測(cè)，人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的平均熒光強(qiáng)度（紅光的平均熒光強(qiáng)度/綠光的平均熒光強(qiáng)度）為2.68、1.34，與陰性對(duì)照5.15、2.02相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三、DDP具有上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞GRP78的表達(dá)的作用 經(jīng)6μMDDP處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP6、16、24h后，用Westernblot法檢測(cè)了人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)，在HNE1/DDP中呈時(shí)間依賴性上調(diào)，自6h起逐漸升高，24h達(dá)到高峰，但在HNE1中上調(diào)趨勢(shì)不明顯。 四、IR具有上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞GRP78的表達(dá)的作用 經(jīng)2、4、6、8、10GyIR處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24h后，Westernblot法檢測(cè)了人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)，在HNE1/DDP中呈劑量依賴性上調(diào)，自2Gy起逐漸升高，10Gy達(dá)到高峰，但在HNE1中上調(diào)趨勢(shì)不明顯。 五、下調(diào)GRP78具有增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP對(duì)DDP及IR的敏感性 1.將不同序列的siRNA-GRP78和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中，用Westernblot法檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中GRP78的表達(dá)，與對(duì)照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中GRP78表達(dá)明顯降低。 2.將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，MTT法顯示，與對(duì)照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中，鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP的存活率明顯下降，說(shuō)明GRP78在鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中具有保護(hù)作用。 3.將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，PI/AnnexinV流式檢測(cè)，與對(duì)照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中，鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP的凋亡率明顯上升，說(shuō)明GRP78在鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中具有保護(hù)作用。 4.將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，PI/AnnexinV流式檢測(cè)單用DDP組、IR組、下調(diào)GRP78與DDP合用組，下調(diào)GRP78與IR合用組，后者的凋亡率明顯升高，與單用DDP組、IR組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，Westernblot方法檢測(cè)下調(diào)GRP78后，促凋亡蛋白Bax、Bak、Puma表達(dá)上調(diào)和抑凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： 1.DDP、IR對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP具有增殖抑制作用，，且隨著照射劑量和DDP濃度的加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率隨之降低，但HNE1/DDP細(xì)胞對(duì)DDP、IR誘導(dǎo)的增殖抑制及凋亡不敏感。作用機(jī)制可能與DDP、IR誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白GRP78的保護(hù)作用相關(guān)。 2.DDP、IR誘導(dǎo)后，HNE1/DDP中GRP78的表達(dá)明顯增加，而在HNE1中GRP78沒(méi)有明顯上升趨勢(shì)。作用機(jī)制可能與GRP78的保護(hù)作用有關(guān)，由此產(chǎn)生了耐藥。 3.下調(diào)GRP78后，HNE1/DDP的細(xì)胞存活率明顯下降，凋亡率明顯上升，抑凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，由此證明GRP78在鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP的保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 DDP IR siRNA 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 引言11-12
• 材料與方法12-24
• 1. 材料與儀器12-14
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法14-23
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)14-15
• 2.2 X 射線照射方法15
• 2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率15-16
• 2.4 PI/AnnexinV 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡16-17
• 2.5 PI 單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡17-18
• 2.6 線粒體膜電位檢測(cè)細(xì)胞凋亡18-19
• 2.7 siRNA 轉(zhuǎn)染19-20
• 2.8 免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)20-23
• 3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理23-24
• 結(jié)果24-34
• 1 鼻咽癌細(xì)胞 HN1/DDP 對(duì) DDP 具有耐藥性24-27
• 2 鼻咽癌細(xì)胞 HNE1/DDP 對(duì)IR 具有放射耐受性27-30
• 3 DDP具有上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞 GRP78 的表達(dá)的作用30-31
• 4 DDP具有上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞 GRP78 的表達(dá)的作用31
• 5 下調(diào) G RP 78 具有增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞 HNE1/DDP 對(duì) DDP及IR 的敏感性31-34
• 討論34-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 致謝42-43
• 附錄43-56
• 附錄A 英中文術(shù)語(yǔ)縮略語(yǔ)對(duì)照表43-44
• 附錄B 主要試劑配制方法44-47
• 附錄C 個(gè)人簡(jiǎn)歷及發(fā)表論文47-48
• 附錄D 綜述48-56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 Malcolm J. Simons;;Nasopharyngeal carcinoma as a paradigm of cancer genetics[J];癌癥;2011年02期

2 宋樂(lè)樂(lè);馬琳艷;張旭東;蔣志文;劉浩;蔣琛琛;;衣霉素聯(lián)合順鉑對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年06期

本文編號(hào)：851236