發(fā)布時(shí)間：2017-09-14 10:30

  本文關(guān)鍵詞：Substance P抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠角膜上皮細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的 體外培養(yǎng)小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系（TKE2），建立高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的小鼠角膜上皮細(xì)胞凋亡模型，通過(guò)添加substance P（SP），研究SP對(duì)高糖環(huán)境下小鼠角膜上皮細(xì)胞凋亡的影響，并分析可能的信號(hào)通路。 方法 1.高糖誘導(dǎo)小鼠角膜上皮細(xì)胞凋亡模型的建立：應(yīng)用小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系（TKE2）作為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的模型，在KSFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)TKE2細(xì)胞，行如下實(shí)驗(yàn)： （1）高糖誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞凋亡的濃度梯度：TKE2細(xì)胞分別采用0、50、150、250、350mM葡萄糖處理24h，采用Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡比例，確定高糖誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞凋亡的最適葡萄糖濃度。 （2）高糖誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞凋亡的時(shí)間梯度：根據(jù)（1）中結(jié)果選定最適高糖濃度，分別處理TKE2細(xì)胞0、12、24、48h，采用Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡比例，確定高糖誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞凋亡的最適時(shí)間。 2. SP抑制高糖誘導(dǎo)的TKE2細(xì)胞凋亡模型的建立：在方法1結(jié)果建立的高糖誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞凋亡模型中分別添加0.1、1、10μM SP進(jìn)行預(yù)處理2h，采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，確定SP對(duì)TKE2細(xì)胞凋亡的影響及其最佳濃度。 3.探討SP抑制細(xì)胞凋亡可能的信號(hào)通路：根據(jù)方法1和2中結(jié)果確定高糖濃度、SP濃度及處理時(shí)間，分析SP抑制細(xì)胞凋亡可能的信號(hào)通路： （1）與NK-1R信號(hào)通路的關(guān)系：在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)添加NK-1R抑制劑L-733,060(1μM)預(yù)處理，而后通過(guò)Annexin V/PI雙染、Caspase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況； （2）與Akt信號(hào)通路的關(guān)系：在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)添加Akt抑制劑(40μM)預(yù)處理，而后行Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)P-Akt、總Akt的表達(dá)。 （3）與氧化應(yīng)激通路的關(guān)系：在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，高糖組中分別添加NAC (1mM)和DPI (1μM)兩種陽(yáng)性抗氧化劑預(yù)處理，與SP組平行實(shí)驗(yàn)，而后行ROS染色、鈣離子熒光探針（Fluo-3AM）染色和線粒體膜電位熒光探針（JC-1）染色檢測(cè)分析細(xì)胞活性氧水平、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和線粒體膜電位變化情況。 結(jié)果 1. HG可誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，以晚期凋亡為主，具有濃度和時(shí)間依賴性。當(dāng)葡萄糖濃度分別為0、50、150、250、350mM時(shí)，TKE2細(xì)胞凋亡比例分別為5.60%、4.87%、7.97%、44.62%、95.51%。當(dāng)用相同濃度葡萄糖分別處理0、12、24、48h時(shí)，各組細(xì)胞凋亡比例分別為6.33%、13.94%、45.11%、66.99%。當(dāng)葡萄糖濃度為250mM、處理時(shí)間為24h時(shí)，TKE2細(xì)胞凋亡模型最理想。 2. SP可抑制高糖誘導(dǎo)的TKE2細(xì)胞凋亡，存在濃度依賴性。當(dāng)SP濃度分別為0、0.1、1、10μM時(shí)，TKE2細(xì)胞凋亡比例分別為44.53%、30.23%、16.95%、21.41%。當(dāng)SP濃度為1μM時(shí)，其抑制細(xì)胞凋亡的作用最顯著。 3. SP發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡可能的信號(hào)通路： （1）SP-NK-1R信號(hào)通路：向SP組中加入NK-1R抑制劑L-733,060(1μM)后，流式分析結(jié)果示HG、HG+SP、HG+SP+NK-1R抑制劑組細(xì)胞凋亡比例分別為33.78%、15.68%、34.32%，加入NK-1R抑制劑組細(xì)胞凋亡比例較SP組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。caspase3、8、9活性檢測(cè)結(jié)果示：SP組與高糖組相比caspase3、8、9表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）,SP組中加入Nk-1Ri，caspase8、9表達(dá)與SP組無(wú)明顯差異（P0.05），caspase3表達(dá)明顯升高，與高糖組無(wú)差異(P0.05)。 （2）Akt信號(hào)通路：向SP組中加入Akt抑制劑(40μM)后，流式分析結(jié)果示HG、HG+SP、HG+SP+Akt抑制劑組細(xì)胞凋亡比例分別為46.70%、15.39%、29.43%，加入Akt抑制劑后，細(xì)胞凋亡比例明顯高于SP組，但仍低于高糖組，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。Western Blot結(jié)果示：高糖組、NK-1R抑制劑組及AKt抑制劑組P-Akt表達(dá)水平較對(duì)照組及SP組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），SP組與對(duì)照組無(wú)差異（P0.05）。各組總Akt表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05） （3）氧化應(yīng)激相關(guān)通路：高糖處理組中分別加入抗氧化劑NAC和DPI，SP組、NAC組、DPI組與高糖組相比，，ROS表達(dá)減弱、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，線粒體膜電位升高，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。高糖組、NK-1Ri組、Akti組三組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論 高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系（TKE2）細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。SP可以抑制高糖誘導(dǎo)的TKE2細(xì)胞凋亡。SP抑制細(xì)胞凋亡的作用與其通過(guò)NK-1R受體，激活A(yù)kt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：Substance P 高糖 細(xì)胞凋亡 NK-1R Akt ROS
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R587.2;R772
【目錄】：

• 研究生導(dǎo)師和指導(dǎo)小組成員介紹5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 主要符號(hào)表14-15
• 引言15-17
• 材料與方法17-35
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料17-20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法20-35
• 結(jié)果35-45
• 2.1 高糖誘導(dǎo) TKE2 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡存在劑量和時(shí)間依賴性35-37
• 2.2 SP 可抑制高糖誘導(dǎo)的 TKE2 細(xì)胞凋亡37-38
• 2.3 SP 抑制高糖誘導(dǎo)的 TKE2 細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路38-45
• 討論45-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 綜述53-60
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果60-61
• 致謝61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 夏長(zhǎng)青;王逸蘭;陸道培;;P物質(zhì)體外對(duì)骨髓CFU-GM和CFU-C_(21)的影響[J];北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1999年02期

本文編號(hào)：849500